【求助】真心求助。。做了两个月的WB，一直没条带

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-10-22 19:45 作者: 6327555 来源: 分析测试百科网

目标蛋白是AKT，CST公司的抗体
蛋白是细胞提取物，从100mm皿，加入200ulRIPA，也加了PMSF跟磷酸酶抑制剂
提取完蛋白直接煮5min，上样量30ul
蛋白大小是60ka的，用8%的胶。电泳80v25min，130v45min。marker也很漂亮的。
转膜是用伯乐公司的半干转，恒流0.4A，限压20V，时间45min。电流差不多保持0.3、0.4A的样子
封闭用BD的奶粉，5%，1h。
一抗稀释用说明书上推荐，用5%奶粉+TBST。推荐浓度1：2000，我1:1000,1:500都试过了。在4°冰箱轻摇过夜
二抗是荧光二抗，1：10000，室温，1h
检测是ODYSSEY的机器直接检测
但是做了这2个月，抗体也试过其他公司的，ACTIN有时候有，有时候没有。目标蛋白要么直接空白，要么很微弱，就是一条细线。

请问各位前辈，大家觉得我是哪里有问题啊？

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【求助】真心求助。。做了两个月的WB，一直没条带

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ha111 (2013-10-22 19:45:49)

actin有时候有，有时候没。说明你基本会WB，但是技术不稳定。新手，多练练。
6327555 (2013-10-22 19:46:15)

QUOTE:
原帖由 ha111 于 2013-10-22 19:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
actin有时候有，有时候没。说明你基本会WB，但是技术不稳定。新手，多练练。
请问一下，新手应该从哪些方面去练熟呢？谢谢
shenkunjie (2013-10-22 19:46:36)

第一技术可能不到位
第二蛋白量可能不够
eve_49 (2013-10-22 19:47:28)

目标蛋白是AKT，CST公司的抗体
蛋白是细胞提取物，从100mm皿，加入200ulRIPA，也加了PMSF跟磷酸酶抑制剂
提取完蛋白直接煮5min，上样量30ul
蛋白大小是60ka的，用8%的胶。电泳80v25min，130v45min。marker也很漂亮的。
转膜是用伯乐公司的半干转，恒流0.4A，限压20V，时间45min。电流差不多保持0.3、0.4A的样子
封闭用BD的奶粉，5%，1h。
一抗稀释用说明书上推荐，用5%奶粉+TBST。推荐浓度1：2000，我1:1000,1:500都试过了。在4°冰箱轻摇过夜
二抗是荧光二抗，1：10000，室温，1h
检测是ODYSSEY的机器直接检测
但是做了这2个月，抗体也试过其他公司的，ACTIN有时候有，有时候没有。目标蛋白要么直接空白，要么很微弱，就是一条细线。

请问各位前辈，大家觉得我是哪里有问题啊？
leifengta (2013-10-22 19:47:59)

如果内参都做不出来的话，应该是处理样品的问题，可能是蛋白降解了，此外，注意：
一是没加蛋白酶抑制剂COCKTAIL蛋白降解了
二是蛋白表达量太低，需加大上样量
三降低BLOCK至0.5-3%之间
四降低洗膜次数
五提高抗体浓度
六是曝光时直接加入4张胶片，曝光5h或过夜，然后看看有没有带。这样做浪费点胶片，不过，做出来有经验后，就可以确定合适的曝光时间，能减少胶片量了
kuaizige (2013-10-22 19:48:28)

Akt这个抗体，CST公司的是很好用的，我以前做过，系统稳定是几乎和actin一样容易做，当然磷酸化的akt要难一些了。我感觉你可能是蛋白提取可能有问题，你可以发一张考染蛋白胶让大家分析分析
kuaizige (2013-10-22 19:48:49)

这是图片，55和72之间

14850408.snap.jpg
6327555 (2013-10-22 19:49:29)

Akt这个抗体，CST公司的是很好用的，我以前做过，系统稳定是几乎和actin一样容易做，当然磷酸化的akt要难一些了。我感觉你可能是蛋白提取可能有问题，你可以发一张考染蛋白胶让大家分析分析

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这位前辈，请问，培养的细胞，是否提取的蛋白会比较不好做？（相对于组织）
谢谢！
kuaizige (2013-10-22 19:49:59)

snowyca wrote:
这位前辈，请问，培养的细胞，是否提取的蛋白会比较不好做？（相对于组织）
谢谢！

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呵呵，相对而言，培养细胞里的Akt更容易做出来的。
6327555 (2013-10-22 19:50:26)

已经解决··更换使用了NC膜，结果很好。看来使用荧光二抗的时候，要注意一下PVDF膜的影响···谢谢各位前辈之前的指点
idea2011 (2013-10-22 19:50:57)

图片好漂亮呀，几乎没有背景。请问你曝光AKT多长时间呢？
还有，我觉得p-AKT真的不好做呀，在想要不要做IP……
kuaizige (2013-10-22 19:51:35)

QUOTE:
原帖由 idea2011 于 2013-10-22 19:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
图片好漂亮呀，几乎没有背景。请问你曝光AKT多长时间呢？
还有，我觉得p-AKT真的不好做呀，在想要不要做IP……
过奖啦，曝光时间一般也就20-30s吧，信号挺强的。p-AKT在磷酸化蛋白中算是好做的了，你需要一个加胰岛素刺激的阳性对照。主要是不要让样品去磷酸化。和你分享我以前做的P-AKT图片吧，上面一排是p-AKT,下面是GAPDH，我把这两个抗体同时孵育的，一次出来内参和目的条带。

88443786.snap.jpg