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【求助】条带跑不开，一片片的
各位老师学长学姐,我跑了三周BAX还没跑出来，刚开始跑出来的现象是 BAX蛋白条带倾斜有重影（附图1）；后来跑着跑着出现了模糊的一带（附图2），这种情况出现了两次了，浓缩胶（100V），分离胶（150V，15%的分离胶），希望有过类似经验的学长学姐 给点建议吧，就两个叮当了，全部家当。祝大家跑电泳成功 【求助】条带跑不开，一片片的
(附图1都是内参，肿么出现了两个条带 )
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最新回复
mingming0638 (2013-10-25 22:08:57)
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ROSE李 (2013-10-25 22:09:28)
建议你重配一下电泳缓冲液~~
印象中Bax分子量不太大，对于较小分子量，电压不要太大，90V分离胶跑时间长一点就应该可以了；
分离胶可以改成12%的应该没问题~~
不知道你这个图是怎么做的，如果是核酸电泳，但你写的是蛋白的条带，电泳条件也是蛋白质电泳的条件；如果是蛋白电泳，但你的图怎么是这个样的——背景是黑的，而条带是亮的？感觉应该是后者，如果这样，那你抗体孵育浓度可能也过高~~
mingming0638 (2013-10-25 22:09:57)
QUOTE:
首先谢谢您的顶帖，我们实验室有个叫UVP的成像系统照的像，是跑的蛋白，内参是GAPDH，刚开始我是跑的200V，内参和目标蛋白（bax）的条带都能出现，但是有重影就像图一这种质量（这个分开的较远，这两个条带都是GAPDH） ；后来图二这个情况出现了两次 ，印象中是电压降低后就出现的（比如今天跑了100v，150v）。我觉得您给的12%很有建设性，因为我一直跑的是15%，再试试您说的降低电压，和12%，（您跑过这个蛋白吗？一般都是用的什么参数：比如电压，膜的厚度，转膜时间）再次感谢ROSE李 (2013-10-25 22:10:28)
QUOTE:
自己没跑过该蛋白的经验，但GAPDH好像只有37大小，和actin内参差不多，不知道你怎么需要那么大的电压还有一点就是胶要保证做好，尤其是分离胶的PH，要充分凝好，才能保证分离效果；
注意电泳缓冲液离子浓度不要太大，检查一下你的配方，不然的话分子量越小会泳动越慢，分离效果就会越差（这个我曾经有两次配的甘氨酸加太多了，后来也有条带增宽的意思，条带还有点波浪）；
做过caspase-3和9的，分子量都很小，个人感觉还是电压小一点分离效果更好一点……
建议，仅供参考~~你可以先只做电泳试一下，电泳保证了再做后面的~~
摆渡客 (2013-10-25 22:11:06)
建议，分离胶12.5%！ 转磨湿转 100v 1h ok
静夜思 (2013-10-25 22:11:27)
图一：GAPDH 出现两条带，不奇怪，只要知道哪条是你要的就行了。
图二：无条带，实验失败，重做。
静夜思 (2013-10-25 22:11:58)
XYZQ (2013-10-25 22:12:20)
我做过BAX，12%的胶，浓缩胶80V跑，分离胶120V跑。PVDF膜0.22微米。转膜条件跟你的转膜装置有关，一般稳流好于稳压，小分子量的适合半干转，大分子量的适合湿转。
33号 (2013-10-25 22:12:46)
QUOTE:
你好，请问BAX分子量大概为多少啊？我最近在做bit-1，属于BAX系列，bit-1分子量为27，你做的时候大概湿转的条件你说一下，分离胶我用的是12%。小分子量不适合15%。mingming0638 (2013-10-25 22:13:26)
QUOTE:
好像是21KD，经过最近的摸索 终于跑出来了，我们是干转（貌似），就是9V恒压 从上往下依次是：负极（—）
三层滤纸
SDS-PAGE
0.45微米膜
三层滤纸
石墨电极（+）
我师姐教我的，祝你也有一个跟我一样好的师姐哦！
mingming0638 (2013-10-25 22:13:46)
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哥们你是干转还是湿转的？多少伏？多长时间？谢谢
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