【求助】蛋白透析沉淀

最新回复

• 小野花 (2013-10-26 20:16:19)

  
  1 透析袋用2%的NaCO3，0.02%EDTA，pH8.0缓冲液煮10min，用蒸馏水冲洗干净再用；
  2 PBS的pH值与目的蛋白的等电点是否一样，不行就换生理盐水试试；

• 987789 (2013-10-26 20:17:53)

  
  提高透析液的pH至8-9.

• xueyouzhang (2013-10-26 20:18:24)

  QUOTE:

  原帖由 987789 于 2013-10-26 20:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  提高透析液的pH至8-9.

  你好，请问为什么要提高透析液的pH值？什么原理呢？谢谢

• 987789 (2013-10-26 20:19:03)

  QUOTE:

  原帖由 xueyouzhang 于 2013-10-26 20:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  你好，请问为什么要提高透析液的pH值？什么原理呢？谢谢

  老老实实说，是长期做重组蛋白纯化的经验。
  
  如果从原理上去理解的话，是不是可以这样去猜想：
  1、蛋白质溶解的重要原因是与水分子间形成了稳定的水化层，
  2、蛋白质沉淀的重要原因是其氨基酸侧链上的疏水基团聚集，
  3、水化层的形成与蛋白质中带电氨基酸之间的电荷-偶极作用有关，
  4、pH影响到R基的电离程度，从而影响到水化层的形成；另一方面可能还与疏水基团有关。
  
  理不清楚，希望大家共同来解惑。

• guagua (2013-10-26 20:19:36)

  各位大虾，请教一个问题，我的蛋白在上清中，镍柱纯化很容易就收到了，但是当用PBS透析时蛋白总是沉淀，也不知道原因出在哪，请各位大虾指点一下，多谢！！！！
  
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  镍柱纯化后蛋白透析发生沉淀这个现象太普遍了，这个和蛋白的性质有关，有些蛋白透析不沉淀，有些蛋白透析就沉淀，这个和蛋白浓度的关系不是太大，但当你浓度过大时，可以先稀释下，稍微降低点浓度再透析，以防发生沉淀；
  个人觉得这个主要和蛋白本身有关，有些蛋白在盐离子强度低的情况下，会蛋白之间发生聚集，由于盐浓度降低，分子间力降低，聚集容易发生，所以透析时会发生沉淀，解决这个方法，个人尝试两种：
  1.使用万金油透析，甘油的存在有时会使分子聚集变得困难些，只要甘油不影响你的实验，你就可以使用该方法，当然，这也不是万能的，有时也会沉淀，但相对于常用的PBS，tris缓冲液能好点；
  2.使用分子筛除盐，这个方法也不咋费事，效果也很不错，这种除盐分子筛没有我们分离蛋白时分子筛那么严谨，长宽比没那么严格，大家可以试试；
  祝好运！

• 12xunmei (2013-10-26 20:20:17)

  看来透析出现沉淀是很常见的问题呢

• 2541 (2013-10-26 20:21:24)

  镍柱纯化后蛋白透析发生沉淀这个现象太普遍了，这个和蛋白的性质有关，有些蛋白透析不沉淀，有些蛋白透析就沉淀，这个和蛋白浓度的关系不是太大，但当你浓度过大时，可以先稀释下，稍微降低点浓度再透析，以防发生沉淀；
  个人觉得这个主要和蛋白本身有关，有些蛋白在盐离子强度低的情况下，会蛋白之间发生聚集，由于盐浓度降低，分子间力降低，聚集容易发生，所以透析时会发生沉淀，解决这个方法，个人尝试两种：
  1.使用万金油透析，甘油的存在有时会使分子聚集变得困难些，只要甘油不影响你的实验，你就可以使用该方法，当然，这也不是万能的，有时也会沉淀，但相对于常用的PBS，tris缓冲液能好点；
  2.使用分子筛除盐，这个方法也不咋费事，效果也很不错，这种除盐分子筛没有我们分离蛋白时分子筛那么严谨，长宽比没那么严格，大家可以试试；
  祝好运！
  
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  你好，我想请问下，对于方法一，是不是可以提高透析液中甘油的浓度，来解决沉淀的问题？
  方法二中，除盐分子筛不了解，能说的详细点吗？

• 12xunmei (2013-10-26 20:22:00)

  你好，我想请问下，对于方法一，是不是可以提高透析液中甘油的浓度，来解决沉淀的问题？
  方法二中，除盐分子筛不了解，能说的详细点吗？
  
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  提高甘油浓度时可以解决一些蛋白沉淀的问题，但甘油浓度过高，对你蛋白本身的后续处理液会带来一些问题啊，如果你觉得你影响你蛋白的后续处理及活性，那随便你。现在有些二抗，活蛋白的浓度都加到了30%以上的甘油，活性也不错。
  分子筛除盐，和常规的分子筛一样，就是没有那些用来分离蛋白的柱子那么严格要求啊，因为蛋白和盐的分子量相差很大。

• pencil菲 (2013-10-26 20:22:33)

  
  和复性是蛋白的起始浓度有关。
  
  看你的蛋白氨基酸顺序里有没有Cys,半胱氨酸多的话容易形成二硫键，分子之间也容易形成，所以复性液里要加入氧化性和还原性谷胱甘肽，这样可以抑制蛋白分子间二硫键的形成，避免大量聚集。
  控制复性的起始浓度，复性是要以缓慢滴加到含一定尿素的复性液里，而且要在磁力搅拌器上，复性至少一天，后用氧化性和还原性谷胱甘肽的缓冲液再次复性1-2天。最后离心去掉部分沉淀。

• 12xunmei (2013-10-26 20:23:20)

  提高甘油浓度时可以解决一些蛋白沉淀的问题，但甘油浓度过高，对你蛋白本身的后续处理液会带来一些问题啊，如果你觉得你影响你蛋白的后续处理及活性，那随便你。现在有些二抗，活蛋白的浓度都加到了30%以上的甘油，活性也不错。
  分子筛除盐，和常规的分子筛一样，就是没有那些用来分离蛋白的柱子那么严格要求啊，因为蛋白和盐的分子量相差很大。
  
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  哦，由原来5%的甘油浓度增大到10%，同时稀释蛋白浓度，终于解决了沉淀问题。谢谢你了