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腹水
各位western blot高手好：
最近开始做western blot,遇到些问题，我先做的actin,不是曝不出来结果，就是有好几条带，感觉很抑郁，请教高手到底是什么问题。首先我说下我的步骤：
1.样品制备：抽取S180或是H22腹水2.5ml，4度离心，12000rpm，10min，弃上清，PBS洗细胞3次，每次都是4度离心，12000 rpm，10min，细胞最后用RIPA裂解液（含PMSF）6ml重悬，冰上裂解30min，并不时震荡使之充分裂解。
2.没有进行蛋白定量，我刚开始是先SDS-PAGE结束后直接染色，直到跑胶跑直了才开始继续往后做的，这个时候我已经把浓度摸好了；
3. SDS-PAGE, 分离胶10%，浓缩胶5%，上样量是8微升，共跑两块胶；浓缩胶80V，分离胶120V；
4. 电泳结束后，一块胶按照Marker切取40-55Kd位置的胶，4度转膜，130mA,1.5-2.0h;另一块胶，考马斯亮蓝染色；
5. 转膜后的PVDF膜丽春红染色（转膜前PVDF膜先用甲醇泡过的），可见清晰条带，跑的比较直，TBST洗至无色后，5%脱脂奶粉封闭1.5-2h；
6. 封闭液稀释的一抗4度冰箱孵育过夜（一抗是santa cruz biotechnology的，rabbit, 我是1:500稀释，因为放置了一年了，效价可能偏低了）（刚开始我直接用TBST稀释一抗的，后来改用封闭液稀释。TBST稀释一抗的时候，我会在封闭之后，一抗孵育之前先TBST洗膜5min的，而改用封闭液稀释后就没再用TBST洗膜了）；摇床转速25/min;
7. TBST洗3次，每次10min;
8. 封闭液稀释的二抗室温孵育2h（二抗是goat anti-rabbit,我是1:1000稀释的，也是因为放置了一年，效价偏低，才用的浓度高）（同样：刚开始用TBST稀释二抗的，后来改用封闭液稀释。TBST稀释二抗的时候，我会在封闭之后，二抗孵育之前TBST洗膜5min，而改用封闭液稀释后就没再用TBST洗膜了）;摇床转速25/min;
9. TBST洗3次，每次10min;
10. ECL显色（我一般根据荧光强度来定压片和显影时间的）
我的问题是：
1.我明明丽春红染色后条带很清楚很直，为什么有时候曝光出来的条带有歪的呢？
2.为什么我用同一个样品，同样的体积，同样的操作条件，有时候ECL加到膜上就看的到，荧光很强，有时候没荧光曝不出来呢？
3.为什么我的样品不管是S180的还是H22的，actin都不只一条带呢，老是有好几条带，这个是什么原因呢？封闭没封好？一抗二抗特异性不强？
这是我曝光的结果，请大家给分析分析原因。感激不尽！
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最新回复
moonlight45 (2013-10-26 21:29:02)
1.我明明丽春红染色后条带很清楚很直，为什么有时候曝光出来的条带有歪的呢？
你看到的未必是抗体作用的蛋白
2.为什么我用同一个样品，同样的体积，同样的操作条件，有时候ECL加到膜上就看的到，荧光很强，有时候没荧光曝不出来呢？
Beta-Actin?
3.为什么我的样品不管是S180的还是H22的，actin都不只一条带呢，老是有好几条带，这个是什么原因呢？封闭没封好？一抗二抗特异性不强？
Santa Cruz 的抗体臭名昭著无人不知! Actin还算好的，你试试其他的，保管你眼花缭乱满世界的花花Bands。这不是调试block条件可以解决的问题，与二抗也毫无关系。赶紧换其他公司的单克隆抗体。我的经验：效果最好的是Sigma Anti-Mouse单克隆抗体（Cat. A1978）。
雪山飞鹿 (2013-10-26 21:29:28)
1，正常。 染出来的蛋白一般都不是你曝光出来的蛋白。而且丽春红染色只能粗略反应，曝光结果更细微。
2，也不奇怪，这说明你自己的WB操作技术不稳定。 多练习。
3，很正常。 有杂带主要是一抗的问题（任何抗体，当然也包括actin都可能出现此问题），但是只要能区分开，而且目的条带也正常，那么抗体就可以用。 没必要换抗体。 除非你分不清目的条带和杂带，才选择换抗体。
moonlight45 (2013-10-26 21:30:12)
QUOTE:
你发表文章时如果只截出这个Band的MW节段也可接受，那就无所谓。但若Reviewer要求全blot图像（我就被这样要求过），你就发上去遍布涂鸦令人目不暇接的全图？除非你把所有杂Band统统PS掉。话说回来要是这样，直接在空白里PS上去理想的Band不就得了？还费尽做试验干啥？ 具体到这个例子，地球人都知道Beta-Actin的典型图像就是漂亮的单Band，也看惯了。如拿出上面的图，换你当Reviewer会对试验的质量作何联想？又会怎样评价作者验证整个题目的态度？utt0989 (2013-10-26 21:31:29)
1、有点歪中间的那种估计是你的胶的问题吧，边上翘可以低电压跑完，中间不变电压。
2、同一个样品，同样的体积 应该是同样的样品，同样的蛋白量，再调成同样的体积 蛋白要定量的，这样你的对照才会一致，才好辨别是否有变化
3至于actin ，我记得有的是有两条带的（具体怎么回事忘记了，你问下santa的技术支持吧），一条很亮一条差点。我觉得应该不是问题，只要相互间没差别就行。实在不行就换GAPDH。
milkdog (2013-10-26 21:32:02)
建议换sigma的actin单抗，或者降低actin一抗和二抗定浓度和孵育时间，可能有助于去掉杂带。
ending (2013-10-26 21:32:38)
1.我明明丽春红染色后条带很清楚很直，为什么有时候曝光出来的条带有歪的呢？2.为什么我用同一个样品，同样的体积，同样的操作条件，有时候ECL加到膜上就看的到，荧光很强，有时候没荧光曝不出来呢？3.为什么我的样品不管是S180的还是H22的，actin都不只一条带呢，老是有好几条带，这个是什么原因呢？封闭没封好？一抗二抗特异性不强？
呵呵呵，正如前面几楼所说，丽春红染色只是一个大概的位置，量多的蛋白会染出来，但是一般不是你的目标蛋白。要解决曝光出来的条带有些歪的问题，可以再曝光时看一下荧光位置再压片，调整一下压片的位置就好。我不提倡先切胶再转膜，虽然可以省点膜，但是位置容易歪，难以对应，而且容易造成短路。
第二个问题，一方面可能是技术不稳定（这个从图片看出来一点），另一方面也可能是上样之前样品没混匀，你又没有做曲线定量，难免会有差异。
actin有好几条带，抗体特异性是一个因素，个人经验在孵育抗体时加入奶粉也可以减少杂带的。曝光的时间也很重要，从图片看来，并不能把握得很好。多一条淡淡的小带还算正常，多好几条就很难说原因了。
zzzz (2013-10-26 21:33:00)
什么组织做的WB，建议换个抗体做做
whitesheep (2013-10-26 21:33:31)
1。我个人觉得你的条带已经很直了啊，一般来说两头的孔只点溴酚蓝不点样的，这个我想你是知道。再就是你可能有意无意的牵拉了膜，或者各种不平整所致，不必在意，太直的反而像假的；我记得我原来一抗牛奶配的
2。 用同一个样品，同样的体积，同样的操作条件是理想状态，万一那天你做的时候供电局提供的电压有波动，万一你用的缓冲液有那么一点点的ph值的差异，万一你的夹子今天松了一点，一部分蛋白就可能还在滤纸上，或者穿越到对面滤纸上了，不要纠结这个问题了，有时候确实要看脸。
3。我建议你摸一下抗体的效价，等比稀释1抗，比如你用1:1000 那你可以从1:500-1:10000设置不同的抗体效价，跑一块胶，看一看什么浓度的抗体目的条带清楚而杂带最少
yysr238 (2013-10-26 21:34:11)
请问“从1:500-1:10000设置不同的抗体效价，跑一块胶，”是什么意思？是不是我跑11个孔，一个marker,10个样品孔，设置几个浓度，如1:1000,1:2000,1:4000；1:8000，转膜完后，PVDF膜上，针对不同浓度一抗取1-2个上样孔孔道分别进行孵育？那二抗呢？也需要这样做么？
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