【求助】一般pET载体最大能表达多大的蛋白？

最新回复

• zranqi_1 (2013-10-26 22:58:54)

  因为从来没有过自己表达的经验，而这个蛋白也是初次发现，所以没有前人经验可循。问题比较初级，大家见笑了。

• laughing妹 (2013-10-26 22:59:36)

  
  我也做过一个105kd蛋白的表达,没有表达,我很想问各位大侠有没有好方法表达大蛋白,因为我还想要这个蛋白.

• plaa (2013-10-26 23:00:11)

  你可以改用pET-28a载体试试看，我曾经
  将大小约为106kd的蛋白连入其中，并经低温
  诱导获得了部分可溶性表达的目的蛋白。
  还有就是上游的酶切测序鉴定步骤，应当
  严格按照程序走，至少保证连接成功，再谈
  下一步的表达。
  再有就是你说的表达效果不好是什么情况？
  表达了但量不够？还是根本就没有表达。情况
  不同，解决方法也不同。
  
  
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  因为我是第一次表达蛋白，就遇到了一个很大的。我用的是pET102D载体克隆，基因有2600多bp，总也转化不进去，每次提质粒了以后size都不对。后来改用pcr来检验，发现有的菌株可以pcr出想要的长度。所以我猜想是否是转化进去的正确的size很少，就尝试诱导表达。效果似乎并不好。在这里诚心请教几个问题：
  pET102最多可以克隆多大的蛋白？100kDa的蛋白对于原核表达是不是太大了？各位有什么好的载体跟方法推荐么？我可以用现在的菌株表达出蛋白么？
  
  问题比较初级，我也在版上的资源里做了一些功课，不知道是不是没找对地方，也没有找到想要的答案。还请大家赐教。谢谢了！

• abc816 (2013-10-26 23:00:37)

  有哪位高手能详细说说表达大蛋白（100KD以上）会遇到的问题？！

• 松子儿 (2013-10-26 23:01:08)

  关键还是看你蛋白的可溶性及原核表达兼容性（稀有密码子、一些真核蛋白特有的翻译后修饰等等），没有定数的，但一般来说>100K的确实不好表达。
  
  建议还是确定克隆成功了再摸索优化表达条件，多换几种载体，特别是有特殊融合序列的载体，如pET28a, pET32a, pBAD/gIII等等。
  
  我在pET32a中成功表达过~110KDa的蛋白，可溶性表达量不算高。

• baidukk (2013-10-26 23:01:36)

  
  如果有条件的话，建议在真核系统中表达，比如在昆虫细胞中表达。一般大于80KD以上的蛋白在原核中都很难表达。即使表达了，容易形成包涵体或表达量低。

• zranqi_1 (2013-10-26 23:02:00)

  我先去试试换载体，如果不行就真核表达，有了结果，不论好坏都向大家汇报。

• zranqi_1 (2013-10-26 23:02:37)

  问题解决了，换了载体，原来的载体里是MBP，后来用了pGEX-4T vector,里面是用的GST fusion，表达很顺利。没有问题了。谢谢大家！

• zranqi_1 (2013-10-26 23:02:57)

  
  对了，原来用的载体是从实验室的人那里要的，他们后来说也没有成功过，我怀疑载体本身就有问题。后来是一个教授提供了pGEX 载体。谢谢npng 的耐心回答，因为没有找到PET-28a 载体，原来的老板又不愿意花钱，所以没有尝试。