【求助】His-tag融合蛋白纯化

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-10-27 11:31 作者: 鹿奔奔来源: 分析测试百科网

各位好，我最近在做一个his-tag蛋白纯化，37度诱导表达，跑SDS-PAGE电泳，看到目的蛋白表达了。纯化用的是NOVAGEN的Ni-NTA his-bind resin，通过binding buffer、wash buffer、elution buffer洗后，各取30ul加5ul 6*蛋白上样缓冲液，在沸水中煮沸5min上样，最后SDS-PAGE上显示我的目的蛋白消失了，但是有三条比较明显的杂蛋白。我是在常温下纯化的。请大家帮帮我！

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【求助】His-tag融合蛋白纯化

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12xunmei (2013-10-27 11:34:13)

纠正一个小错误：各取30ul加5ul 6*蛋白上样缓冲液
这个应该是各取25ul加5ul 6*蛋白上样缓冲。6*中已经包括了自己的1倍。

其它请上SDS-PAGE图，图的说明，以及详细的纯化过程。
鹿奔奔 (2013-10-27 11:34:59)

表达蛋白图，目标蛋白66KD左右

38638076.jpg
鹿奔奔 (2013-10-27 11:35:35)

纯化后SDS-PAGE图

25945790.snap.jpg
鹿奔奔 (2013-10-27 11:37:28)

上样顺序依次为marker、bufferB流出液、bufferC流出液、bufferD流出液1和2、bufferE洗脱流出液
kswl870 (2013-10-27 11:37:58)

可能是你的蛋白没有表达啊
PAGE图只是参考
你至少应该用his-tag的单抗做western鉴定一下
如果没有反应，就是那个蛋白没有挂上HIS 标签
所以纯化自然就没有结果了
鹿奔奔 (2013-10-27 11:40:27)

那我图1上面表达的不是我的目的蛋白吗
dotaaa (2013-10-27 11:41:11)

如果是表达的话，这个表达量确实很大
应该没问题啊
这么大的表达量是在什么条件下得到的啊
kswl870 (2013-10-27 11:41:42)

你的破菌上清，破菌沉淀，以及上柱前的样品SDS-PAGE呢？

另外，要给出所用marker的分子量。

纯化规模，用的多大的柱？
PCR (2013-10-27 11:42:05)

His-tag融合蛋白可能以不溶性包涵体形式存在。
douding66 (2013-10-27 11:42:33)

如果柱子不是新买的话，估计你的柱子是有问题了~
雪原 (2013-10-27 11:43:05)

先做个WB看看表达和分子位置。
33号 (2013-10-27 11:43:42)

第一，不能确定哪条带是你的目的条带，尽管可能是靠近66KD的那条，也可能不是啊。你可以对照下未表达蛋白的全细胞提取液和表达蛋白后的全细胞提取液。看看是不是多出来那条66KD的条带。也可以做western确认。
第二，即便那条带是目的蛋白，但是你的bufferB里有那么多，说明蛋白没有结合到柱子上。有没有可能你的载体插入片段里没把终止密码子去掉，所以his tag没表达出来？或者是结合缓冲液有问题？总之得找到原因，否则还没洗脱蛋白就没了
shenkunjie (2013-10-27 11:44:11)

his标记的蛋白在SDS-page胶上的分子量比原来目的蛋白的大5-10kDa，因为his含组氨酸带正电荷，跑得慢。
dmg (2013-10-27 11:44:41)

天哪,居然有和我一样的情况,唉,同病相连,我也是蛋白纯化着就不见了,郁闷着跑来论坛看看,看大家有什么高招了呢!
101010 (2013-10-27 11:45:02)

binding buffer、wash buffer、elution buffer配方分别是什么？
还有bufferB流出液、bufferC流出液、bufferD流出液1和2、bufferE中的BCDE分别是什么？