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【求助】如何让包涵体的His标签暴露出来
【求助】如何让包涵体的His标签暴露出来
做pET-32a(+)的原核表达做了一段时间，表达出来的蛋白是包涵体。因为还有别的试验，边做边纯化包涵体。做了半年时间，也没什么太好的效果。就感叹没有人帮助真的是很困难，这么简单的一个试验做了这么久。我现在纯化包涵体，共计要超声10个小时左右，才得到一点点沉淀。尿素溶解后，上1微升样蛋白看起来很纯，上20微升，觉得还是一塌糊涂。由于超声时间过久，反而还出现了一个新的条带，估计是蛋白给破坏了。
最近带师弟做原核表达，还是用的pET-32a(+)，就是在下游引物没有加上终止子，结果表达出来之后，用我买的国产的填料就纯化出来了。我自己的蛋白当初没有在末尾加上终止子，这也是参照我之前一个老师做的才这么做的。那个蛋白也是包涵体表达。我之前自己用填料纯化就是纯化不出来，现在看来是自己的N端的His标签没有显露出来。开始我还以为国产的货质量不好，看来是自己错了。
现在我有一个问题，有什么办法能让我的蛋白的His标签裸露出来从而被填料吸附？我的蛋白用8M尿素溶解后依然是没办法挂上填料。希望诸位战友多多帮忙。哎。。。做的真郁闷啊。问题啰嗦了点，有发牢骚的嫌疑，希望不要见怪。。。
再补充一个问题，就是说我的蛋白虽然是包涵体表达，但是最近为了准备毕业论文的时候做了温度梯度诱导的比较，低温的时候也是有可溶表达的。但是以前做的时候，觉得反正用填料纯化不出来，只好让他表达包涵体还好些。现在不知道如果可溶表达的话，那是否His标签就能被纯化出来呢？
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最新回复
loli (2013-10-27 17:25:20)
很简单,用盐酸胍溶解样品,尿素做平衡和洗脱都不变就可以可.盐酸胍能使尿素不变性的部分变性,标签暴露更充分,当然也需要好填料,有的填料手臂过短设计不合理,就有回能纯化的蛋白种类少.
12xunmei (2013-10-27 17:25:58)
太强悍了，超声10个小时？你的蛋白太经得起折腾了。包涵体的纯化需要长时间的超声吗？我一般破碎细菌后用去垢剂和低浓度变性剂处理沉淀后就能得到较纯的包涵体。不是很明白你后面的问题，是蛋白不挂柱还是提纯蛋白的纯度不够？如果是不挂柱，用His表达蛋白有可能由于你蛋白的末端被包埋导致挂柱不稳，最好的解决方法是换一端加Tag。一般的蛋白用8 M Urea 已经足够变性了，加盐酸胍溶解效果不会太明显，用可溶性蛋白粗提物也可能不管用。如果是纯度不够，提高你的粗提液的蛋白浓度和洗脱杂质的咪唑浓度。
remonte (2013-10-27 17:26:40)
QUOTE:
其实我也不想超声10个小时，但是我提取包涵体总是遇到奇怪的事情。以前超声半个小时，离心的时候结果是分层的，上层是未破碎的菌体和一些细胞碎片，下层是包涵体。但是后来超声半个小时左右居然离心不分层了。尽管说洗涤几次包涵体之后得到了看起来很白的沉淀，我也以为很纯了。结果尿素溶解后，条带却很杂。于是我就觉得里面还有菌体在。于是我就延长了超声的时间。尽管说提出来的东西仍然不是很纯，但是远比之前要好。所以在我没办法做到更好的情况下，只能继续这么做了。我自己诱导表达的蛋白超声破碎久了，下面明显出现了一条新的条带，小分子量的，但是我确实没有办法了。因为再加标签，从头做起已经没有时间了。不然我也就从头开始了。
谢谢你的回复。
remonte (2013-10-27 17:27:25)
昨天将菌体破碎后的沉淀在6M盐酸胍中溶解，用填料吸附。电泳检测后发现吸附前后的条带无明显差别。洗脱下来的蛋白浓度非常低，看来只好放弃这个方法了。
打算用之前看到的，将这次的蛋白用丙酮沉淀然后再跑胶，切胶后回收看看。反正样品也没办法回收到了，我就多尝试下看到的方法吧。谢谢诸位的帮忙了。
loli (2013-10-27 17:27:52)
盐酸胍干扰电泳，必须用尿素或水清洗填料后再跑才可以，轻言放弃怕很难做好实验的．此外如果你蛋白吸附少，变性条件下这很正常，通常１－２mg/ml很常见,所以千万别用太少填料做实验.
remonte (2013-10-27 17:28:18)
也说不上放弃吧，因为时间有限，没办法把什么东西都做的很好。以前就因为这样，做一个实验都要用上一两个月。也谢谢你的指点，我有空的时候还会继续尝试的。因为实验室的摇床全都给人摇了什么东西。一摇就是一个多月，没办法摇菌了。。。
zhihui小新 (2013-10-27 17:29:02)
其实你可以这样：
破菌，离心后，去上清。将沉淀用含1%Triton X-100或者2M的尿素溶液悬浮，超声（5s/15s/20 cycle,300w）,完了，离心，去上清（也可以留样电泳，看洗涤的效果），重复一到两次。
溶解包涵体，用6M 盐酸胍或者8M 尿素，或者0.2%的sarkosyl都行，（注意不要引入EDTA同时保证pH大于7），离心后，上镍柱，用镍柱纯化，注意在纯化过程中始终保持变性剂的浓度，否则蛋白会沉淀。洗脱后再做复性。这样得到的蛋白应该会很纯。
仅供参考。
remonte (2013-10-27 17:29:28)
可能是因为我的菌体放的太多了吧。我是2L菌液收集的菌体，加50ml左右的PBS缓冲液，然后超声。这个方法是我同学给的，不过他们也就超声半个小时就够了。其实难说的很，之前我跟他讨论了半天，最后他来我们这看了下，发现我们的超声探头比他们的小很多。于是我换了大号的，但是仍然没有什么很好的效果。因为他过来的时候正巧我们离心机坏了，没办法做，只能说很郁闷吧。
谢谢诸位。
greenbee (2013-10-27 17:31:06)
我勒个去了，楼主你也真敢，呵呵，希望不要介意，只是被你的超声体系给雷到了，2L的菌您用50Ml去超，是不是有点太超量了？建议1L的菌用50ml去超，或者每次20ml，分两次超声，另外，超声的探头和超声的程序、以及超声的功率也要考虑进去。千万不要再超10个小时了，太可怕啦。
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