【求助】pet32a到底融合蛋白有多大

最新回复

• seagate (2013-10-29 21:44:52)

  
  首先要确定你插入的片断C端有没有终止子，如果有，那么trx－tag、his－tag、s－tag，DDDK酶切位点等融合片断一共大约为18KD，加上你的目的蛋白400AA，融合蛋白应该为62KD左右。

• dmg (2013-10-29 21:45:44)

  
  非常感谢，那我在不到20kd和40多kd有两条目的条带，那40多kd的是不是目的条带呢？

• seagate (2013-10-29 21:46:17)

  
  如果你表达的目的融合蛋白经过纯化、EK酶切，那么20KD以下位置的条带是融合片断部分，40多KD带就是目标蛋白。
  如果你做的是菌体电泳，不应该有这两条带，应该只是60KD左右带。
  如果你的菌体经过破菌处理，取上清做电泳，那么可能会有融合蛋白降解形成20、40KD带。这时要考虑破菌条件，减少融合蛋白降解。
  
  下次问问题请将条件说清楚，“不到20kd和40多kd有两条目的条带”是在什么情况下出现的。
  祝表达成功！

• dmg (2013-10-29 21:46:53)

  谢谢，我确实没有说清楚。我是全菌直接跑电泳，没有进行超声粉碎，然后转膜，用his抗体做western blot检测后，发现有两条条带，一条是20kd，一条是40多kd，而未诱导的全菌只有20kd的条带。这个怎么解释呢？

• seagate (2013-10-29 21:47:20)

  能否将你的电泳图和western blot上传看一下。
  未诱导的全菌western也能显色20KD的带我没法解释，即使是基础表达也应该是和诱后一样，只是弱一些而已。

• dmg (2013-10-29 21:47:59)

  
  在marker旁边是未诱导的全菌，其他是诱导后的。可看到在20kd、40kd有两条条带。

• seagate (2013-10-29 21:48:22)

  
  对不起，这几天没有上网。
  刚看到你的图，首先你的图照反了，我只有大致猜一猜。
  所谓20KD的带在我看来完全可以忽略，和你的主带相比弱多了。
  marker边上的诱导前菌的两条带应该不是，可能是相邻上样孔的溢出。
  你的MARKER在最边上，所以条带扭曲，对应目标蛋白条带在你所说的40KD应该比这大，我认为就是融合蛋白60KD的带。
  把你的电泳图也发上来看一看，别反了。

• dmg (2013-10-29 21:48:54)

  太谢谢你了，看来可能是了。我没有做电泳染色这一步，我想western blot 比它特异多了。

• biabiade (2013-10-29 21:50:04)

  
  顺便问一下，肠激酶酶切下的融合蛋白有多大？我的表达蛋白113aa，没有抗体，能分离出来吗？

• ns5fan (2013-10-29 21:50:25)

  
  肠激酶酶切下的融合蛋白对pET32来说应该有17－18k左右，但我在查看文献和自己实验中发现条带在14k左右，原因不明！？！？阿

• bling (2013-10-29 21:50:58)

  
  是啊 ，有trx－tag，s-tag,his-tag,dddk,共130多个aa，分子量应该在18kd左右。我的表达蛋白113aa，差不多13、4kd，怎么分离二者呢？高手指点啊！

• dreaming (2013-10-29 21:51:21)

  
  PET32载体的空白蛋白应该有26KD的样子，融合后的蛋白不一定是简单的相加，可能会略有差别。