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【求助】RIPA提蛋白，离心后总是没有沉淀，浓度也很低
【求助】RIPA提蛋白，离心后总是没有沉淀，浓度也很低
各位大侠，小的最近提了很多次贴壁细胞的蛋白，PBS洗后，吸净，25cm2的细胞加150~200μL,6孔板加100μL的碧云天RIPA(加入PMSF),冰上裂解30min,4度，13000转，离心20min,总是没有沉淀看到。
还尝试过加了裂解液直接用刮刀迅速刮刀1.5ML离心管里继续冰上裂解30min，离心后，仍没有沉淀；
或者胰酶消化下来，PBS洗涤后，加RIPA裂解，加RIPA之前还能看到离心后管底的细胞很多，加了RIPA吹打，冰上裂解后，离心还是没有任何沉淀。
测的浓度都很低，只有0.1，非常焦急，不知是怎么回事。换了同学的裂解液还是这样。
跟我一同提的同学沉淀就有很多，是不是因为我比他多裂解了15min的原因呢？他裂解了15Min，我裂解了30min;
第一次提的时候加了RIPA400μL，只等了几分钟就刮下来去离心了，那一次是少量的沉淀，浓度测出来是5点几，莫非裂解时间长了？那没有沉淀核酸之类的杂志都去哪里了呢？
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最新回复
tie8 (2013-10-31 16:14:09)
要用细胞刮使劲的反复在细胞瓶底部刮，这样才能提到蛋白。
xiaoxiaoniao (2013-10-31 16:14:40)
QUOTE:
多谢大侠指点，我觉得我已经比较用劲的刮了，我也怀疑是没刮干净，刮了很久后拿到倒置显微镜下看，有些地方还残留一些小小圆圆的东西，不知是不是细胞呢？和细胞形态是不一样的。xiaoxiaoniao (2013-10-31 16:15:17)
实在是太郁闷了，我提的蛋白一直浓度低做不出来，昨天测的浓度只有1点几，上样40μg，现在正在二抗孵育中，把膜丽春红染了根本就没染上。。。这次不会又做不出来了吧。。。这是为什么啊为什么啊，以前也可以提出来的啊，浓度也有5点几。。。
tie8 (2013-10-31 16:16:28)
要不你这样，取10*6个细胞，pbs清洗2遍，最终20ul pbs重悬，然后直接加loading buffer电泳，或者加20ul蛋白提取液，然后再加loading buffer电泳。这样就可以确保你这些细胞的总蛋白都在你的上样液中。
同时建议你做sds-page时最好做2份平行组，一份用于下面的westen实验，一份直接考马斯亮蓝染色观察蛋白条带是否正常。
fei1226com (2013-10-31 16:30:46)
RIPA裂解后蛋白不是应该在溶液里吗，为什么要看沉淀里的蛋白
xiaoxiaoniao (2013-10-31 16:31:22)
同时建议你做sds-page时最好做2份平行组，一份用于下面的westen实验，一份直接考马斯亮蓝染色观察蛋白条带是否正常。
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哦~~长见识了~~那就是不要加裂解液也可以是吗？这样蛋白电泳的时候也能分开条带是吗？
我是转膜后的胶考马斯亮蓝染了一下，发现没有条带，膜用丽春红染了几次也没有条带。。。。。。
昨天又提了一次，及其用力的刮下细胞，裂解时间缩短到10min,离心后发现有很少的沉淀，测浓度有1点几，做完显影没有看到条带，用丽春红染膜发现是有蛋白条带的，于是想是不是一抗二抗的或者显影液的问题，用一滴二抗和显影液混在一起去显影，发现是可以显影的。然后就怀疑是不是一抗结合的不好，就用一抗二抗去除液洗去一抗二抗，重新封闭，结合一抗二抗，只有一部分条带显出来了，很弱，其他都还是没有显影。
xiaoxiaoniao (2013-10-31 16:31:41)
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只是很疑惑，为什么别人和我用一样的裂解液，就出现很多沉淀，我的为什么就没有。第一次提蛋白测出来浓度比较高的时候都是有很多沉淀的，现在没有沉淀了，那细胞膜的那些碎片或者核酸什么的不是应该在沉淀里了吗？难道我的全裂解掉了？还是细胞根本就没有刮下来呢？或是我刮的太狠了......真是搞不明白。。。其实也不是关心沉淀，只是想提的蛋白浓度高一些，现在很苦恼啊~~~
youyou99 (2013-10-31 16:32:13)
RIPA裂解30min或15min都是可以的了，RIPA的裂解能力很强的，
沉淀的多少与细胞的数量及裂解程度相关，RIPA在冰上裂解过程中，最好用加样器用力吹打几次
希望你测蛋白含量用的不是沉淀，而是收获的上清；
yychen (2013-10-31 16:32:48)
我是转膜后的胶考马斯亮蓝染了一下，发现没有条带，膜用丽春红染了几次也没有条带。。。。。。
昨天又提了一次，及其用力的刮下细胞，裂解时间缩短到10min,离心后发现有很少的沉淀，测浓度有1点几，做完显影没有看到条带，用丽春红染膜发现是有蛋白条带的，于是想是不是一抗二抗的或者显影液的问题，用一滴二抗和显影液混在一起去显影，发现是可以显影的。然后就怀疑是不是一抗结合的不好，就用一抗二抗去除液洗去一抗二抗，重新封闭，结合一抗二抗，只有一部分条带显出来了，很弱，其他都还是没有显影。
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转膜之后胶上应该没有条带，但膜上丽春红染色应该有条带的。说明你的转膜以上（包括转膜）步骤已经失败了。不知道你怎么做的。所以你做2组sds，先看看电泳有没有问题，到底有没有蛋白，再研究转膜有没有失败。
glass (2013-10-31 16:33:06)
你可以尝试RIPA裂解1H后再超声10秒左右
leifengta (2013-10-31 16:33:28)
收细胞的时候细胞是能看到的，如果你能看到细胞并且确认，应该就没问题了。
duoduo (2013-10-31 16:33:50)
QUOTE:
是看到细胞了~~但是加了裂解液裂解后，上清浓度总是很低。。。奇怪了。。。duoduo (2013-10-31 16:34:13)
沉淀的多少与细胞的数量及裂解程度相关，RIPA在冰上裂解过程中，最好用加样器用力吹打几次
希望你测蛋白含量用的不是沉淀，而是收获的上清；
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多谢前辈指点，细胞是10cm培养皿，长的几乎满了，加了500μL裂解液，刮下来收集到EP管理，冰上裂解30min,裂解过程也吹打了，取的是上清，测的浓度一直都是1左右。难道是因为刮得太狠了？（因为之前测浓度总是很低，所以担心是细胞没有刮下来，于是就很大力滴刮了~~）这个和刮细胞的力度有关系吗？
INK (2013-10-31 16:40:42)
1. 细胞数量与细胞的大小有关，细胞个大越大，相同面积相同满度下与其他细胞相比，数量也是少些的
2. 你蛋白测量用考马斯亮蓝还是BCA，用RIPA的话就应该用BCA法，BCA的1相当于考的6~7左右
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