查看完整版本请点击这里：
【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白
【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白
我在做原核表达的过程中，使用了pET-28a载体，Rosetta（DE3）表达菌株，但是37℃诱导表达后，连包涵体都没有看到，基本没有任何的蛋白表达，所以想请问一下大家，能不能帮我分析一下是什么原因？谢谢。
PS：我的目的蛋白大量重复序列，是否是由于重复序列导致蛋白在表达过程中无法折叠，如果是这个原因有什么办法可以解决，谢谢。
查看完整版本请点击这里：
【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白
【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白
最新回复
vvmmoy (2013-10-31 21:25:30)
我也是用的pET-28a载体，转到BL21感受态细胞中表达，暂时还没有检测蛋白。请问楼主是用什么方法知道你的蛋白没有表达的呢
damingxia0904 (2013-10-31 21:26:00)
1、测序，确定读码框无问题
2、连到真核表达载体上，看看有无表达
3、有无稀有的氨基酸
4、表达菌是否有你的质粒所需要的转录表达元件？
5、诱导试剂是否失效？条件是否合适？
豆荚 (2013-10-31 21:26:30)
=========================================
SDS-PAGE啊，我跑的全菌，没有见到目的条带。
豆荚 (2013-10-31 21:26:47)
2、连到真核表达载体上，看看有无表达
3、有无稀有的氨基酸
4、表达菌是否有你的质粒所需要的转录表达元件？
5、诱导试剂是否失效？条件是否合适？
=============================================================================================
谢谢您的建议，但是您所提的5项均没有问题，我跑的是全菌体（上清+包涵体），理论上只要有表达就可以看到条带。
豆荚 (2013-10-31 21:27:12)
2、连到真核表达载体上，看看有无表达
3、有无稀有的氨基酸
4、表达菌是否有你的质粒所需要的转录表达元件？
5、诱导试剂是否失效？条件是否合适？
=====================================================================================
毕赤酵母真核表达体系正在构建，但是我现在想找出原因分析为什么在原核表达体系中没有任何表达，谢谢。
jingling845 (2013-10-31 21:27:36)
你可以用软件预测一下mRNA的二级结构，看看是否是由于重叠序列造成的
mRNA结构可以使用,RNAstructure,
cuturl('http://www.bio-soft.net')
简单方便.密码子的偏爱性,可在翻译以后,人工完成.
预测RNA二级结构如下进行：
1. 选择file|RNA fold singlestrand启动模块，单击sequence按键，打开对话框以载入序列，此序列必需以.SEQ为扩展文件名，其它序列文件可在序列编辑器中转为此格式。注意必需为大写字母。
2. 输入文件名后，缺省值将填充在剩下的区域，这些值可改变。选取 Generate Save File选项，在执行算法后生成存盘文件，此存盘文件用于重新折叠与生成点阵图。
3. 在此碱基可被强制为单链或双链或螺旋。
4. 单击开始键，开始预测运算。
5. 需要的话，选择Draw structure，在绘图模块中看预测的二级结构结果。输出的二级结构以最小自由能顺序排列。但由于方法的限制与热力学参数的简化，第一个结构并不一定为实际的RNA结构，
要折叠一个已存贮为.seq文件的序列，可选择菜单选项file|fold RNA singlestrand，直接进入折叠窗口。或单击工具条中的fold RNA single strand键。
biabiade (2013-10-31 21:27:57)
豆荚 (2013-10-31 21:28:42)
QUOTE:
重复几次后电泳没有问题。WB鉴定是有一条非常细的带，但是考染见不到条带，即使WB有条带由于量非常少，也无法用于后续的实验。所以我想请教一下大家，看大家有什么好的建议，帮助我分析一下原因，谢谢。【求助】pET-28a原核不能表达目的蛋白