【求助】双向电泳电压上不去

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-10-31 21:58 作者: ero11 来源: 分析测试百科网

肝脏研磨，细胞裂解液提取（7M尿素，2M硫脲，4%的CHAPS，40mM的Tris），20000转离心取上清，使用丙酮过夜沉淀后，在使用细胞裂解液溶解，跑双向，发现等电聚焦电压上不去，到约800V，怀疑是Tris的问题，用3K的超滤膜超滤后用不含Tris的裂解液复溶后在跑双向发现电压还是上不去，更低了才300v。
为什么啊？愁死了，谢谢帮助。该怎么除掉盐，还是有核酸，脂肪啥的啊。
补充：阴极端有白色物质
经过各位的帮助，我已经跑出一张图了，不过还有很多问题，就是碱性端聚集，胶条是3-10的。请各位继续帮帮我谢谢

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【求助】双向电泳电压上不去

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ero11 (2013-10-31 21:59:03)

没有啊，电压上不去，一向没有跑完我就给它停了啊
ALALA (2013-10-31 21:59:38)

蛋白浓度测定了没？？你上样前那裂解液的组成是什么啊？？
ero11 (2013-10-31 22:00:21)

QUOTE:
原帖由 ALALA 于 2013-10-31 21:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

蛋白浓度测定了没？？你上样前那裂解液的组成是什么啊？？
裂解液成分7M尿素，2M硫脲，4%的CHAPS，没有测定浓度，因为用BCA试剂盒测的时候，干扰太大，没有测出来。
vvmmoy (2013-10-31 22:00:54)

不定量，你怎么确定你的上样量，这些都是有范围的，不是你意向想上多少就可以上多少的？建议你重新测蛋白浓度，如果觉得BCA法不好的话，就braford法测，这个相对来说对试剂的干扰性小点，当然，如果有条件的话，买定量试剂盒测更好，先把这步做好，再找你的问题。
先说下，电压上不去的原因有很多，初次判断就是样本盐离子高，缓冲液里的盐离子高等，所以很多时候会建议先除盐，不过你的是动物的肝脏组织，其实不用除盐也是可以的，我们实验室做过肝脏肺脏，胰腺，都没有经过除盐，跑出来的结果也还不错，你可以看文献上也很多是用一步提取法，直接上样跑的，所以你出现的这个问题，是可以通过合理的操作改进或优化的。
祝你好运！
ALALA (2013-10-31 22:01:20)

裂解液成分7M尿素，2M硫脲，4%的CHAPS，没有测定浓度，因为用BCA试剂盒测的时候，干扰太大，没有测出来。

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你不加DTT,和载体两性电解质，可以直接跑等电聚焦吗？
njkph (2013-10-31 22:02:02)

除盐没除好
ero11 (2013-10-31 22:02:25)

你不加DTT,和载体两性电解质，可以直接跑等电聚焦吗？

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上样前加了DTT和IPGbuffer
ero11 (2013-10-31 22:03:04)

这次重新丙酮沉淀后，用新配的裂解液溶解，超滤后上样，本以为还行呢，现在预设电压跑8000v,10h，现在跑了1个半小时了，才到1500v，电流50uA（到了限定的值了），好没有信心呢。（前面低电压的到还是可以的）
jiushikeshui371 (2013-10-31 22:03:27)

这样吧，你试试我这个protocal，我这样做是可以的。
将冻存的样本组织称量得60mg,放进匀浆器，先加入蛋白酶抑制剂protease inhibitor cocktail 20ul，再加入600ul裂解缓冲液(7M尿素，2M硫尿, 4% CHAPS，2%IPG缓冲液(载体两性电解质)(PH3-10)，40mMTris, 120mM DTT,)在超声波清洗器中，间歇式超声再静置，超1min静置3min,如此反复，总共30分钟，再以19000g/mim，4℃下离心30mim，收集上清液，用Bradford法测定蛋白浓度，蛋白质提取液可置于-80℃冰箱保存。
13cm,pH3-10，线性胶条，上样量600ug,等点聚焦程序：Step1:100v,1H,;Grad2:200v,1H,;Grad3:500v,1H,Grad4:1000v:1H;Grad5:8000v,3H;Step6:8000V,50000VH
ALALA (2013-10-31 22:03:51)

你最后是怎么样除盐的啊？？电压上去了吗？？