【求助】阳离子交换层析缓冲液的选择

最新回复

• bs4665 (2013-11-05 17:43:07)

  
  理论上来说，只要是pH值大于10.3即可，但是实际上是要尝试比较不同的缓冲液，选择最优条件。

• hustwb (2013-11-05 17:43:25)

  这么高的PI，也可考虑做阴离子交换层析，缓冲液的pH可选择在目的蛋白PI值以下，让目的蛋白流穿，杂蛋白挂柱。

• mamamiya (2013-11-05 17:43:48)

  
  阳离子交换树脂本身带负电荷，应该与带正电荷的蛋白质结合，等电点为10.3的蛋白质，应该在pH<10.3的缓冲液中带正电荷，所以采用阳离子交换剂，应选择pH小于pI的缓冲液；楼上两位所说似乎颠倒了？
  至于是否选择阴离子还是阳离子交换剂，这取决于目的蛋白的稳定pH范围，如果在高于pI范围内稳定则选择阴离子交换剂，在低于pI范围内稳定则选择阳离子交换剂。

• jkobn (2013-11-05 17:44:08)

  
  我认为理论上应是pH值小于10.3，如果是用阳离子交换层析。因为pH值小于
  等电点，蛋白质带正电荷．用磷酸盐缓冲液即可．洗脱时可加大盐浓度或pH值大于10.3的Ｔris-Hcl缓冲液．这要根据蛋白在哪种缓冲液中更稳定而决定．

• mamamiya (2013-11-05 17:44:29)

  
  起始缓冲液的pH值和离子强度应使样品有效成分与阳离子交换柱结合，而杂质不与交换柱结合，所以pH一般比目的蛋白pI低1个单位，离子强度为0.1时，就可以很快把目的蛋白和杂质分开了。当然反之也可以选择缓冲液pH和离子强度使目的蛋白与离子交换剂结合不牢固而使杂质结合牢固。使用阳离子交换剂一般选用阴离子缓冲液，如乙酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、磷酸盐等。
  洗脱液的离子强度和pH应使目的蛋白从离子交换剂上解离，我们一般采用改变离子强度的梯度洗脱，这样可以使蛋白质分离更彻底。

• wood533 (2013-11-05 17:44:48)

  
  楼上说的对。建议使用阳离子树脂，磷酸盐缓冲液，需要考察蛋白质的稳定性。

• newway (2013-11-05 17:45:29)

  阳离子交换树脂本身带负电荷，应该与带正电荷的蛋白质结合，等电点为10.3的蛋白质，应该在pH<10.3的缓冲液中带正电荷，所以采用阳离子交换剂，应选择pH小于pI的缓冲液；楼上两位所说似乎颠倒了？
  至于是否选择阴离子还是阳离子交换剂，这取决于目的蛋白的稳定pH范围，如果在高于pI范围内稳定则选择阴离子交换剂，在低于pI范围内稳定则选择阳离子交换剂。
  
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  同意你的说法,另外还应该注意所选择的PH 值应该使目的蛋白和树脂的亲和力达到最大,同时杂蛋白和树脂的亲和力最小,从而在洗脱时达到纯化的目的.
  祝楼主好运!

• flower@@ (2013-11-05 17:45:54)

  
  谢谢大家。我选用了pH9.0的磷酸Buffer.

• cwcwcww (2013-11-05 17:46:12)

  pH9.0的buffer最好用tris作为缓冲剂

• mamamiya (2013-11-05 17:46:30)

  
  我所讲的是采用阴离子交换柱层析，采用pH10.3以下的缓冲液，让目的蛋白流穿（flowthrough），杂蛋白挂柱，这样也可能起到纯化作用。

• utt0989 (2013-11-05 17:46:53)

  
  磷酸缓冲液，或者是HEPES

• H2O (2013-11-05 17:47:12)

  
  直接用7.4的磷酸盐试试吧,9.0的磷酸盐似乎不好.

• mysmdbl (2013-11-05 17:47:32)

  
  看到大家的互相帮助，我感到温馨，我是一个刚刚入门的新人，一时说不出真知灼见，但愿做实验的姐妹兄弟都有信心与好运气，不论遇到什么困难！

• dongdongqiang (2013-11-05 17:47:55)

  pH9.0的buffer最好用tris作为缓冲剂
  
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  阳离子交换树脂不宜采用tris盐，因tris与树脂有相互作用

• star#room (2013-11-05 17:48:18)

  
  原则上所用的缓冲液不能与树脂有作用，但是也有用作用的缓冲液成功的例子。
  建议采用磷酸盐缓冲液pH7.5,阳离子交换树脂挂柱。
  你用pH9.0的磷酸缓冲液是不合理的，因为9.0的磷酸盐缓冲能力很弱！

• kulee (2013-11-05 17:48:43)

  可以选择让目的蛋白挂柱或者穿透，多数蛋白的等电点在5.5-7.5，所以也可以考虑将目的蛋白穿透来做第一步的纯化。