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【求助】HIS-TAG融合蛋白纯化时有杂带

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-11-08 17:45    作者: jiushikeshui371    来源: 分析测试百科网

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【求助】HIS-TAG融合蛋白纯化时有杂带
我原核表达的蛋白用QIAGEN公司的Ni-NTA Superflow进行纯化接着跑SDS-PAGE，我的目标蛋白是110KDA，但在50KDA时还有一条很粗的条带，在其地方也有一些杂带但不是很明显，我也用不同浓度的咪唑进行洗脱了，但还是有，我刚看了一些贴子还是没有找到很合适的办法，请高手解答，谢谢了。另外纯化后一般用什么方法来检测蛋白的活性。我表达蛋白的目的是接下来要做PUll-DOWN的?再问一个问题，在超声波破碎时需要加Nuclease和lysozyme吗？
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最新回复

  • windy+++ (2013-11-08 17:46:03)


    如果Ni柱解决不了，建议不要在上面费功夫了。可以试试别的方法，像离子交换啥的，试试先

  • ukonptp (2013-11-08 17:46:22)


    上图，看看杂带的比例

  • ending (2013-11-08 17:46:41)


    跟表达的蛋白有关 不行就是重新构建载体了 实在不行可以切胶回收

  • feima+ (2013-11-08 17:47:00)

    过下分子筛不就行了

  • qianqin1977 (2013-11-08 17:47:17)

    比如用大肠杆菌表达的蛋白很多时候杂蛋白虽然没有组氨酸标签，但是过镍柱去不掉，以前我也有这种情况

  • bluelake (2013-11-08 17:47:38)


    楼主最好贴张图上来看看，方便分析。
    有时候用Ni-NTA也是无法一步到位的，常常需要结合其他的层析方法。
    或者在上Ni-NTA之前尝试一下硫酸铵沉淀。

  • abc816 (2013-11-08 17:47:59)


    那个杂蛋白是不是和你的蛋白一起下来的？如果是，有可能是二聚体。你可以试试加大盐浓度，也可以加0.1％Triton，可以减少非特异的离子吸附和疏水吸附

  • redbutterfly (2013-11-08 17:48:16)


    我的也是有杂带，郁闷，坐等答案

  • idea2011 (2013-11-08 17:48:35)

    再加一个离子交换，或者疏水，或者分子筛，不要指望一次过镍柱就能达到很高的纯度。
    一般而言第一次过镍柱能达到85%以上，已经是一个很不错的结果了。很多时候只有70%左右。即使优化后也是如此。

  • kewanqi2011 (2013-11-08 17:48:55)


    这个，感觉有点本末倒置了。首先你得了解你的蛋白有什么活性，然后才去表达检测。必须要对蛋白很熟悉，才能更好地选择表达系统和纯化方案。
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