【求助】原核表达出来的蛋白纯化后怎么是三条带呢

最新回复

• damingxia0904 (2013-11-09 09:25:37)

  我的蛋白表达出来以后
  用的是pet32a
  做了western
  后来进行了纯化
  western的时候就看的是三条
  纯化以后怎么也是三条啊
  这是怎么回事呢
  载体是没有问题的
  测序正确没有移码
  挑的也是单克隆啊
  我的蛋白里面半胱氨酸很多 不知道有没有关系

  
  10639935.jpg

• u234 (2013-11-09 09:26:03)

  
  这要看你用什么方法纯化的了， 有些纯化的方法就是纯化的不完全容易有杂蛋白，要不然再用其他的方法再纯化一次，或者是原方法再摸下条件。

• damingxia0904 (2013-11-09 09:26:28)

  QUOTE:

  原帖由 u234 于 2013-11-9 09:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  这要看你用什么方法纯化的了， 有些纯化的方法就是纯化的不完全容易有杂蛋白，要不然再用其他的方法再纯化一次，或者是原方法再摸下条件。

  纯化方法是菌液裂解上清过0.22 ?m滤膜并通过Ni2+-NTA亲和层析柱进行的

• tangxin_80 (2013-11-09 09:26:50)

  我用的也是Ni柱纯化，基本上也都会有蛋白存在，但是含量不高，原来我还想破了脑袋想要用凝胶过滤再纯化一次，但是老板说叫我就直接试试做下游的实验，现在的实验结果是提取得到的蛋白有活性的，就不再纠结纯化的问题了。有文献说Ni柱纯化是容易有非特异性条带的出现的。

• damingxia0904 (2013-11-09 09:28:31)

  QUOTE:

  原帖由 tangxin_80 于 2013-11-9 09:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我用的也是Ni柱纯化，基本上也都会有蛋白存在，但是含量不高，原来我还想破了脑袋想要用凝胶过滤再纯化一次，但是老板说叫我就直接试试做下游的实验，现在的实验结果是提取得到的蛋白有活性的，就不再纠结纯化的问题了。有文献说 ...

  那我想请问一下你纯化以后做了透析没有呢，我下一步是要做多克隆抗体，现在在看透析需要注意的问题，有好的经验跟我分享一下吧！我的是锌指蛋白，等电点是8.48，融合蛋白大小大约35kD。

• utt0989 (2013-11-09 09:28:49)

  
  是否是目的蛋白出现了降解 ?

• tangxin_80 (2013-11-09 09:29:10)

  
  1 我做多抗用的是变性蛋白，我老板说只要有抗原表位就可以制备多抗。我的方法是直接SDS-PAGE后把目的蛋白从胶上切下来（用的是负染法），再跑次胶看看切胶下的蛋白是否含有杂蛋白，只要小心按着目的蛋白的线切基本上我切的都没杂蛋白，然后BCA法测蛋白浓度后，加入佐剂超声乳化（冰浴)后就可以去免疫兔子了，目前我此实验正在进行中。
  2 关于透析的问题，除做多抗外我还要提取有活性的蛋白做下游的实验，就会在Ni柱纯化完后用PBS透析，这个过程中我也是经历了很多次蛋白变性沉淀下来。原因众多，我的解决方法有透析时PBS试不同的PH值，要远离蛋白的等电点。此外，你也可以把透析后的蛋白离心后把上清和沉淀SDS-PAGE看上清里有没有蛋白，要是有的话就可以取上清去做实验了。

• sunnyB (2013-11-09 09:32:17)

  
  我的也是同样的问题 三条带位置接近

• yonger (2013-11-09 09:32:37)

  在原核表达中，当诱导后，部分目的蛋白会出现合成不完全，或折叠不完全的现象，由于其与目的蛋白结构和大小非常接近，用一次或两次不同的层析是很难纯化好的，需要用不同的层析方法来进行纯化方法。必要时也可以降低诱导剂的浓度，诱导时的温度等。

• bring (2013-11-09 09:33:50)

  
  请问楼主怎么附加图片的呢，我到现在都不会附加图片，谢谢了

• zsxan1990 (2013-11-09 09:35:27)

  
  好像ni柱纯化有时候是会出现两条带（距离很近），可能和histag有关，但第三条带肯定是杂带。如果楼主要切胶的话，可以用凝胶反复冻融法结合丙酮沉淀制备适当浓度的抗原，有需要可以详细讨论。