【求助】GST纯化高浓度GSSH洗脱

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• ending (2013-11-09 11:23:13)

  QUOTE:

  原帖由 nikonun 于 2013-11-9 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  请问GST纯化时用高浓度GSSH洗脱会不会影响蛋白活性?100mM/ml的GSSH

  "100mM/ml"写错了吧？能配得出来吗？应该是”100mM/L“吧。
  一般洗脱用10mM/L GSSH就够了，用高浓度意义不大。
  如果担心100mM/L的GSSH影响GST的活性，建议可以先脱盐(分子筛或透析等均可)。
  不过，一般GST并不是目的蛋白，需要考虑GST的活性吗？

• bamboo16 (2013-11-09 11:23:50)

  透析除去GSSH效果好吗？

• yonger (2013-11-09 11:24:13)

  如果样品体积小，建议过分子筛柱；如果样品体积较大，建议利用透析方法。

• bamboo16 (2013-11-09 11:24:34)

  谢谢！样品体积很大，我试了透析的方法，GSSH好像确实除去了，不过这期间蛋白降解了很多。我打算取一部分用超滤管试试。

• yonger (2013-11-09 11:25:00)

  QUOTE:

  原帖由 bamboo16 于 2013-11-9 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  谢谢！样品体积很大，我试了透析的方法，GSSH好像确实除去了，不过这期间蛋白降解了很多。我打算取一部分用超滤管试试。

  在纯化过程中，加些蛋白酶抑制剂，如PMSF等。

• bamboo16 (2013-11-09 11:26:08)

  我确实加了，但是不管用。

• kuohao17 (2013-11-09 11:26:26)

  
  用G25去除GSH吧，上样体积可以到柱体积的1/3,操作起来很快的。

• nikonun (2013-11-09 11:26:50)

  谢谢更正！是100mM/L的！过GST时，目的蛋白不会发生降解吧？GST融合蛋白只不过是纯化出来，包括了GST和目的片段。我想问的是如果纯的融合蛋白中含有高浓度的GSSH洗脱剂时对其活性的影响？

• fox_79 (2013-11-09 11:27:07)

  
  100mM?那么高？我用的最高的就20mM,还得赶紧放在-20冰箱。

• nikonun (2013-11-09 11:27:38)

  只是现用现配,为什么要防在-20冰箱呢?如果是担心GSH活性丧失的话,那么接下来的过柱不也是在常温下吗,你用的手工柱还是AKTA连接的柱子?

• nikonun (2013-11-09 11:27:54)

  
  过柱时用预冷的ＰＢＳ，再将接洗脱液的容器置于冰中可大大减少温度的影响！其实我个人觉得高浓度的ＧＳＳＨ对蛋白没什么影响．只不过跑胶时会看到自己的样品是金黄色的，不过也不会影响跑胶．甚至我在考虑是不是ＧＳＳＨ会有保护蛋白被氧化降解的作用？个人愚见，望大家指教！

• bamboo16 (2013-11-09 11:28:10)

  
  我要用洗脱的蛋白包板子（ELISA），担心过高浓度的GSSH会影响板子上抗原抗体反应的结合位点。
  不过我发现透析除去GSSH后蛋白虽然降解不少，但降解后的蛋白仍具备原蛋白所带的抗原性，故我的问题可以认为解决了。

• u234 (2013-11-09 11:28:35)

  
  用mllipore的超滤离心管。选取1/3目的蛋白孔径的，3500rpm，15min离心一下就好了