【求助】15%PAGE电泳考染和转膜后染膜17KD以下蛋白不明显？

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标题:【求助】15%PAGE电泳考染和转膜后染膜17KD以下蛋白不明显？

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近在做小分子17KD蛋白，电泳和转膜后未见明显小分子蛋白，附上转膜后立春红染色图片一张，图中17kd到10kd相应位置的蛋白少，似弥散，模糊不明。考染后蛋白分布也是这样（未附图）。请大家给点意见。急！！！

附件

2013-11-9 15:39

92413671.jpg (49.15 KB)

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发表于 2013-11-9 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的电泳的电压是多少，电压大或者电泳时间长容易把小分子蛋白弥散了

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的六一的电泳槽，100V恒压2.5h。这是新跑的一张。做了两个月了，目的蛋白都没有结果，心里着急啊，希望大家指点一下。

附件

2013-11-9 15:40

36332496.jpg (51.69 KB)

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

时间长了半小时左右可以了

eric930[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是用六一的，一般是225ma，2h。从你的立春红染色来看，没有转移成功，不知道你的上样量多少。建议是做个梯度上样量，用我这个条件试一试

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问一下楼上战友，你的225mA，2h是电泳时间？也是小分子的蛋白么？六一的转膜槽小分子用的什么条件，我用的20V过夜。
内参曝光都没有问题，就是17KD的目的蛋白出不来。

xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的蛋白是12KD的，电泳100v 2.5h，蛋白会不会弥散啊，还有对于这么小分子量的蛋白转膜的时候有什么要注意的吗，我用的是PDVF膜，20v 20min，会不会把我要的蛋白转走了啊？最近几次都没做出来很急！

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 xingyi08 于 2013-11-9 15:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的蛋白是12KD的，电泳100v 2.5h，蛋白会不会弥散啊，还有对于这么小分子量的蛋白转膜的时候有什么要注意的吗，我用的是PDVF膜，20v 20min，会不会把我要的蛋白转走了啊？最近几次都没做出来很急！ ...

你用20V20min转膜，这么短时间，蛋白能转过来么？立春红染色有蛋白么？

8s5g[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

染胶发现条带弥撒的，说明电泳条件不太好。我是过跑十几KD的蛋白，12％PAGE的条带反而比15%的清晰，你可以试试。

dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2013-11-9 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

所用的转膜仪器不同时间不一样也很正常 Bio-rad就只需要20分钟

可以试试不转膜只染胶这样可以确定是转膜前还是转膜后的问题转膜前就要考虑蛋白量、电泳液等的问题转膜后就是转膜时间、凝胶三明治制作的问题了

WB就是这样只能慢慢摸条件了淡定

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