【求助】15%PAGE电泳考染和转膜后染膜17KD以下蛋白不明显？

最新回复

• NBA (2013-11-09 15:39:58)

  
  你的电泳的电压是多少，电压大或者电泳时间长容易把小分子蛋白弥散了

• zzzz (2013-11-09 15:40:28)

  
  我用的六一的电泳槽，100V恒压2.5h。这是新跑的一张。做了两个月了，目的蛋白都没有结果，心里着急啊，希望大家指点一下。

  
  36332496.jpg

• ukonptp (2013-11-09 15:40:49)

  时间长了 半小时左右可以了

• eric930 (2013-11-09 15:41:11)

  
  我也是用六一的，一般是225ma，2h。从你的立春红染色来看，没有转移成功，不知道你的上样量多少。建议是做个梯度上样量，用我这个条件试一试

• zzzz (2013-11-09 15:41:34)

  
  问一下楼上战友，你的225mA，2h是电泳时间？也是小分子的蛋白么？六一的转膜槽小分子用的什么条件，我用的20V过夜。
  内参曝光都没有问题，就是17KD的目的蛋白出不来。

• xingyi08 (2013-11-09 15:41:58)

  我的蛋白是12KD的，电泳100v 2.5h，蛋白会不会弥散啊，还有对于这么小分子量的蛋白转膜的时候有什么要注意的吗，我用的是PDVF膜，20v 20min，会不会把我要的蛋白转走了啊？最近几次都没做出来 很急！

• zzzz (2013-11-09 15:42:22)

  QUOTE:

  原帖由 xingyi08 于 2013-11-9 15:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我的蛋白是12KD的，电泳100v 2.5h，蛋白会不会弥散啊，还有对于这么小分子量的蛋白转膜的时候有什么要注意的吗，我用的是PDVF膜，20v 20min，会不会把我要的蛋白转走了啊？最近几次都没做出来 很急！ ...

  你用20V20min转膜，这么短时间，蛋白能转过来么？立春红染色有蛋白么？

• 8s5g (2013-11-09 15:46:23)

  
  染胶发现条带弥撒的，说明电泳条件不太好。我是过跑十几KD的蛋白，12％PAGE的条带反而比15%的清晰，你可以试试。

• dongdongqiang (2013-11-09 15:46:41)

  所用的转膜仪器不同 时间不一样也很正常 Bio-rad就只需要20分钟
  
  可以试试不转膜 只染胶 这样可以确定是转膜前还是转膜后的问题 转膜前就要考虑蛋白量、电泳液等的问题 转膜后就是转膜时间、凝胶三明治制作的问题了
  
  WB就是这样 只能慢慢摸条件了 淡定

• zzzz (2013-11-09 15:46:58)

  
  这是同一次电泳后一个孔染胶和其他孔转膜后立春红染色的图片。大家看看跑胶是否正常，100V,2.5h.<17KD的蛋白是不是这种分布？怎么10KD位置上下都没有看到条带？

  
  11711145.jpg

• zzzz (2013-11-09 15:47:31)

  0.22umNC膜，六一湿转20V过夜，立春红染色。是不是小分子蛋白转过了？

  
  35146141.jpg

• zzzz (2013-11-09 15:47:58)

  
  我们实验室有人做15kd的，也是用12%的胶，但是他不把17KD_11KD之间的带跑的特开，效果还可以，使用半干转，1h10min

• windy+++ (2013-11-09 15:48:16)

  
  小分子量蛋白是比较难做的。不知你要做的是多少kDa的。我做过15kDa的。我的经验是配12%的胶就够了，还有跑电泳不要跑到太下面，溴芬兰跑到2/3就可以了，越跑下面蛋白越容易弥散，转膜其实不用转过夜的，恒流200mA一小时就可以了。关键在于一抗，你买的一抗比较好的话就能压出条带来，还有蛋白上样量要大一点的。转好膜直接用牛奶封闭就行，不必用丽春红染色，即使有小分子条带也不一定是你想要的目的条带。总的来说，Western Blot中数一抗最重要。我的经验仅供你参考哦！

• 8s5g (2013-11-09 15:48:42)

  我们实验室有人做15kd的，也是用12%的胶，但是他不把17KD_11KD之间的带跑的特开，效果还可以，使用半干转，1h10min
  
  ================================
  
  这位同志可以说一下转膜电压吗。谢谢

• ero11 (2013-11-09 15:49:02)

  
  用12%的胶跑,不用跑得太靠下,一般2/3就可以了;
  还有丽春红染色不见条带,不一定说明转膜没有成功,可以继续往下做的.

• avi317 (2013-11-09 15:49:20)

  我跑21KD的　也没见条带！转膜用的是20ｍA过夜　膜上看到Mａｒｋ！可曝光没见条带

• tuuu2 (2013-11-09 15:49:39)

  
  跑胶的问题。
  marker跑的好，样本并不一定就好。
  我跑12%和15%的胶，14kD以下的都分不好。改成Tricine胶，用16.5%以后才分的可以。现在用20%的胶，分离2kD的蛋白都很好

• flower-201 (2013-11-09 15:49:58)

  你曝光过没有呢？
  我觉得也许没有问题，小条带本身就不容易看到的。不知道你的是内源性的还是过表达的。
  你考染和丽春红染色无果并不代表曝光也一定不行，毕竟曝光更灵敏些。
  总之你先曝光试试再说吧。
  不过还是建议你跑胶转膜条件要调整下。
  跑胶不要太久，100v，1h足够了，转膜用80v，1-2小时，转膜时间不要过短了，一二十分钟好像不行，转不上去。如果是PVDF膜的话，一般两三个小时也不会转过的。