查看完整版本请点击这里：
【求助】蛋白在透析过程中产生沉淀，如何解决？
我做的蛋白是一个小分子多肽（结构简单，无2硫键，只有一个a螺旋），4K左右，等电点11，与TRX融合表达，TRX等电点5.4，融合蛋白理论等电点9。融合蛋白经Ni柱纯化，都没有问题。就是在纯化后透析时，老是有沉淀产生。透析内液为20mM PBS+0.5M NaCl（PH7~8），刚开始我是用DW外液直接透析除盐，有沉淀产生。后把外液换为20mM Tris盐酸+0.1M NaCl（PH7~8），4度透析，每8个小时换一次液，换3次，结果第一次换液时肉眼就能看到沉淀，，，无语中，，，不知哪位大侠能够解答，万分感谢！！！【求助】蛋白在透析过程中产生沉淀，如何解决？
PS：听说加甘油可以防止蛋白聚沉，透析之前我加了5%甘油，但还是有沉淀，是不是甘油加量不够？正常加多少合适？
谢！
查看完整版本请点击这里：
【求助】蛋白在透析过程中产生沉淀，如何解决？
【求助】蛋白在透析过程中产生沉淀，如何解决？
最新回复
dmg (2013-11-09 23:21:36)
我也遇到过这个问题，不过后来解决了，建议添加至0.5M L-精氨酸，5%甘油，1%甘氨酸，PH调至8.0，另外采用梯度透析法，应当没有问题的。
abc816 (2013-11-09 23:22:01)
QUOTE:
添加了精氨酸 甘氨酸的透析液，透析后会对细胞试验由影响吗？梯度透析我采用的是
500mM NaCl，4M 尿素，20mM Tris-Hcl;
250mM NaCl，2M 尿素，20mM Tris-Hcl;
125mM NaCl，1M 尿素，20mM Tris-Hcl ;
也是有沉淀，目前准备添加5%甘油，1L透析液里加50ML甘油，不知道效果会怎么样？
dmg (2013-11-09 23:22:20)
由于我透析后的蛋白做抗原的，所以添加这2种东西没有影响，至于后期做细胞试验，由于精氨酸和甘氨酸浓度导致盐离子浓度很大，估计有一定影响，可以细胞试验前做个超滤或过个柱做个缓冲液置换。
另外，我做过几十个蛋白，发现L-精氨酸在的情况下，不会产生沉淀，但如没有精氨酸，只添加甘氨酸和甘油情况下还是会有沉淀，说明精氨酸的助溶能力强一些。以上建议仅供参考。
小螺号 (2013-11-09 23:22:38)
为什么透析内液含盐那么高？是纯化时防止非特异性结合么？ 有些蛋白对盐比较敏感，建议纯化用不含盐的缓冲液试试！
另外有点没看懂，你用镍柱纯化，怎么洗脱的？咪唑还是PH降低？
精氨酸助溶作用很强，一般精氨酸存在的情况下都不会沉淀，但是去除精氨酸还是会有沉淀，如果用作细胞实验的话不建议用精氨酸，因为首先一点蛋白浓度就不好测了！
huifeng0516 (2013-11-09 23:22:57)
baidukk (2013-11-09 23:23:20)
QUOTE:
透析就可以除去，但是你的蛋白可能还会沉淀！baidukk (2013-11-09 23:23:42)
===============================================================================================================
我还有个问题，加了保护剂沉淀是少了，但是我还要用肠激酶切去Trx及His,发现切不开，是不是保护剂影响了酶切反应，还是因为酶切时蛋白量（0.1ug/ul）太低???疑惑ing
yychen (2013-11-09 23:23:59)
你增加离子强度，或者调整PH试一试，可能不是没切开，是吸附到一起了，或者因为静电作用遮蔽了酶切位点。
Ao7 (2013-11-09 23:24:36)
在不影响后面试验的条件下，可以考虑加一些保护蛋白和氨基酸，另外乙二醇作为保护剂也是不错的
c86v (2013-11-09 23:25:07)
PS：听说加甘油可以防止蛋白聚沉，透析之前我加了5%甘油，但还是有沉淀，是不是甘油加量不够？正常加多少合适？
谢！！！！
=============================================================================================================
纯化得到目的蛋白是很开心的事，但一般好多情况下，目的蛋白透析时候会出现沉淀，即使不沉淀（幸运），融合蛋白在被蛋白酶酶切后可能目的蛋白也会聚集沉淀，这是由于目的蛋白析出点比较低。
常规的方法如下从而起到保护蛋白，将融合蛋白透析到含一定盐的溶液中，但盐的浓度不能影响蛋白酶的活性，否则不好后面的酶切实验；至于加入甘油、精氨酸这些分子，会在一定程度上阻碍蛋白之间的分子间，防止蛋白聚集，但有时甘油会影响蛋白的后续试验，而且甘油不易从蛋白溶液中去除。精氨酸价格也不便宜，至于会不会影响蛋白活性，则不是很清楚。
个人觉得比较好的就是使用分子筛来除盐，个人理解为在除去盐的同时给蛋白自由恢复的空间，蛋白也不聚集。可以酶切前过分子筛，也可以在酶切后过分子筛这取决于你的蛋白。
祝好运！
lixi559 (2013-11-09 23:26:44)
我也遇到过这种情况，用过柱子脱盐的方法还是好些
yysr238 (2013-11-09 23:27:01)
tie8 (2013-11-09 23:27:33)
另外，我做过几十个蛋白，发现L-精氨酸在的情况下，不会产生沉淀，但如没有精氨酸，只添加甘氨酸和甘油情况下还是会有沉淀，说明精氨酸的助溶能力强一些。以上建议仅供参考。
==============================================================================================================
您好，
我的蛋白切掉tag后浓缩过程中出现沉淀，浓缩前加L-精氨酸是否可能减少沉淀的产生？ 我试过加10%的甘油，几乎没有用。另外，您所说的加精氨酸是在开始准备纯化蛋白的时候就加入呢，还是只在透析或中间的某个步骤中加入呢？最后，我想问的是对于用来结晶的蛋白，整个纯化步骤中都加入L-精氨酸会不会对结晶有影响呢？
谢谢！
jujuba (2013-11-09 23:27:57)
还有一个原因，可能是你透析时蛋白浓度较高。建议透析时，蛋白浓度不要太高，控制在1.5mg/ml 以内。
【求助】蛋白在透析过程中产生沉淀，如何解决？