【求助】western 白板问题

最新回复

• star#room (2013-11-10 20:09:07)

  
  我转膜的条件是300ma,2个小时，我的目的蛋白是120kd，但就是白板，问原因

• bluelake (2013-11-10 20:09:32)

  QUOTE:

  原帖由 star#room 于 2013-11-10 20:07 发表
  新提取的蛋白，跑胶预染marker跑得挺好，转膜后marker也在PVDF膜上，膜上的marker条带都清晰，转膜液我测了下PH值，8.0多，转膜后用立春红的染色，膜上没显示蛋白条带，胶用考马斯亮蓝染了没有蛋白条带，新配5%BSA室温孵育一小时，BSA我 ...

  什么蛋白？

• star#room (2013-11-10 20:10:46)

  胞浆和胞核都有，84kd

• skytree (2013-11-10 20:11:49)

  
  是不是转膜槽的电极接反了？

• star#room (2013-11-10 20:12:50)

  不可能，marker在膜上的

• tangxin_80 (2013-11-10 20:13:17)

  
  你好，我也遇到了跟你一样的问题，我们用的转膜槽是国产的，200mA转2h，周围的冰会化，转完之后一摸转膜液是热的，肯定影响转膜效率吧？刚才看到一贴，有人说是染料转到膜上了，而蛋白没上去
  
  请问内参用的什么？一般内参分子量都不大，300mA，2h不会转过吗？

• ending (2013-11-10 20:13:41)

  
  我实验室用的350mA 1小时，一直都挺好

• star#room (2013-11-10 20:14:05)

  
  你们实验室用的多厚的胶？谢谢

• finger (2013-11-10 20:14:25)

  
  时刻注意下你的转膜电流，我也有过那个情况，是跑了一段时间后，由于接触不良没有了电流，膜上会有marker 但是蛋白没有转到胶上

• dreaming (2013-11-10 20:14:59)

  新提取的蛋白，跑胶预染marker跑得挺好，转膜后marker也在PVDF膜上，膜上的marker条带都清晰，转膜液我测了下PH值，8.0多，转膜后用立春红的染色，膜上没显示蛋白条带，胶用考马斯亮蓝染了没有蛋白条带，新配5%BSA室温孵育一小时，BSA我也测了PH值，7.0左右，中性。一抗4度过夜孵育，二抗室温下一小时，TBST10minx3，然后ECL发光，进入暗室膜上没有荧光，压片也是白板。显影液我检查过是好的，二抗也用ECL试过，曝光后显黑色，二抗和ECL，胶片，显影液应该都没问题了，但是问什么胶片就是白板，连actin都没有，目的条带更没有，做了三次都这样，之前都是好的，突然就这样，敢问高人原因啊？谢谢。难道是一抗原因吗？一抗我买的都是CST的，三只一抗都是白板，之前都做的挺好的，求高手分析，谢谢
  
  ============================================================================================================
  
  首先丽春红染不上色问题很大，可以重新配丽春红试试，注意样本是不是还有效，有没有煮样过度，或者放的时间过长，下次加大样本量看看
  然后转膜缓冲液重新配一下，是不是那个盐有问题
  可以更换封闭剂试一下，是不是封闭过度，换成脱脂奶粉试试