【求助】各位做GSTtag酶切的时候......

最新回复

• abc816 (2013-11-10 20:18:06)

  
  酶切后的产物(理论上只有GST融合头+目的蛋白),用GST柱子去亲和，发现洗脱下来的产物，除了有GST蛋白，连目的蛋白都被一起抓了出来，和流穿（流传中同样也是有GST和目的蛋白两个带）比较，没有看到明显的差异
  
  似乎目的蛋白不知道什么原因和GST蛋白一起被GST柱子给亲和出来了，而不是像理想中的那样都在流穿

• hustwb (2013-11-10 20:26:30)

  
  这样酶切后难分离的情况我记得也见到过，因为理论上用凝胶柱好分离，但是也没分开，我觉得也许它们直接还有特别的作用力，所以还是结合在一起。

• abc816 (2013-11-10 20:27:22)

  QUOTE:

  原帖由 hustwb 于 2013-11-10 20:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  这样酶切后难分离的情况我记得也见到过，因为理论上用凝胶柱好分离，但是也没分开，我觉得也许它们直接还有特别的作用力，所以还是结合在一起。 ...

  那偶是不是该去买个彩票，这种小概率事件都让我遇上了Tongue
  
  我也是猜测，虽然肽键被切开了，但是可能因为氨基酸的配位或者亲电作用，两个被切开的蛋白切开后就又靠在一起。
  
  有人说，他也遇到过，后来用离子交换分开的
  
  图上“GST穿透1/2泳道”为酶切产物再过GST亲和柱的穿透（理论上GST亲和柱吸附GST标签蛋白，穿透中剩下目的蛋白）
  “GST泳道”为GST亲和柱洗脱的产物（上面一条粗带为GST标签蛋白25kd,下面的一条细带为目的蛋白11KD）。
  

  
  71215153.snap.jpg

• hustwb (2013-11-10 20:28:11)

  
  如果离子柱子能分开也许是电荷电荷作用力，如果是疏水可考虑加表面活性剂试试。

• abc816 (2013-11-10 20:28:35)

  针对这2种思路，我昨天已经安排对比实验了
  
  一组样品加1M NaCl 改变样品缓冲液的电荷
  
  另一组加TRITON-X100

• abc816 (2013-11-10 20:30:13)

  
  最近发现，貌似用超滤可以分开
  
  用10KD的超滤管，截留比较好，但是回收率低（因为GSTtag是26KD，目的蛋白12KD）
  用30KD的超滤管，回收率高了，但是GST有泄漏

• abc816 (2013-11-10 20:37:32)

  
  真是奇怪啊，用柱子纯化的时候，这2者看似粘附在一起。
  
  但是超滤却能分开

• 阿凡提 (2013-11-10 20:39:24)

  我也遇到你的问题，切下的蛋白和柱子结合了，我的蛋白23kd，GST 26kd，用不了凝胶过滤，请问还有什么方法能将蛋白洗下来，不胜感谢

• vtongli (2013-11-10 20:42:30)

  用离子交换，或疏水试试

• vvmmoy (2013-11-10 20:43:38)

  
  用分子筛层析应该可以纯化。GE的superdex75分子筛层析柱26kD和12kD的蛋白峰分的开。你可以试试。
  
  见图中的峰4和5，一个是25kD，一个约12kD，可以很好的把GST和你的目的蛋白分开。

  
  99895788.png

• nikun230 (2013-11-10 20:44:00)

  楼上的回答对了一半，因为GST天然状态下是个dimer所以是26*2=52KD,所以用75的柱子确实分离效果能比较好，另外楼主说30KD的浓缩管确实有几率能分开12KD的蛋白和Dimer状态下的GST