【求助】转膜后低分子量蛋白条带模糊

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• PPT (2013-11-10 20:48:08)

  
  page胶的浓度是否合适？用稳定的小分子量蛋白做个对照，以排除电泳系统问题。

• hot_hot_hot (2013-11-10 20:48:31)

  
  我觉得问题可能出在转膜参数的选择，100V转2h转膜20kd多一点的蛋白不合适。一般，我转膜actin这样40几kd的蛋白都只是用100V转1h就足够了，你的转膜时间估计有点太久了。至于其他的，选择12-16%的分离胶、用0.22的膜等方法似乎不是首先要考虑的解决办法。我一直都是用10%的分离胶，只是小分子量蛋白的位置自己小心截取就行了。所以我觉得你还是考虑转膜过头的问题，用试一试。注意转模式后放入冰袋，保证转膜效率。

• hot_hot_hot (2013-11-10 20:49:31)

  
  所以我觉得你还是考虑转膜过头的问题，再试一试。注意转模时候放入冰袋，保证转膜效率。

• tie8 (2013-11-10 20:49:49)

  
  你可以尝试用两张PVDF或者NC膜，转膜后同时把两张膜都用丽春红或其他燃料染色

• 987789 (2013-11-10 20:50:11)

  谢谢各位，我也觉得可能是转膜时间有点长。老板觉得不是转膜的问题，说是同样的条件分子量稍高的可以转的很好，低分子量的不好可能是上样量的问题。我是用Lowry's法定蛋，按定的量来看每孔都上到200微克了。我觉得不是上样量的问题。我先按照各位的意见试试。
  跑电泳我刚开始用的是12％分离胶，每次Marker只跑出来5条带，后来就加大浓度到14％，Marker 6条带都跑出来了，不知道这样会不会对小分子量的有影响？
  转膜是湿转，6℃水浴

• 987789 (2013-11-10 20:50:27)

  
  补充：膜是NC膜，好像是0.45的孔径，孔径是不是有点大了？

• guagua (2013-11-10 20:50:49)

  
  是有点大,我一般转20几K的,都用0.22的

• lorri (2013-11-10 20:51:16)

  
  转膜时间过了，我也做过25kd 的RhoA，CDC42蛋白，转膜情况是：100m
  A ,30MIN,冰浴下转膜。这个方法却不会错，你可以试试。

• taoshengyijiu (2013-11-10 20:51:36)

  
  第一膜的孔径肯定是大了，而且时间也太长了点。胶的浓度还不是最关键的问题，只要控制小蛋白截留在胶上就行了。

• viviwang1987 (2013-11-10 20:52:02)

  
  我转膜后丽春红染色也是看不到小分子蛋白的条带，内参 GAPDH的目的条带总是做不出，会不会是膜孔径大的缘故？