【求助】western结果非常怪，大家帮忙分析一下

最新回复

• dragonkilly (2013-11-10 22:16:37)

  
  这是今天的图！请大家多帮忙！
  

  
  89130099.jpg

• 12xunmei (2013-11-10 22:16:57)

  
  转膜时又没有降温措施，凝胶有没有皱缩

• dragonkilly (2013-11-10 22:17:17)

  
  我用的是mini VE的转印系统，转印blot外面加了1L的水，电泳槽外用冰水浴的，降温应该还可以，我原来转印blot只加了300ml缓冲液也还可以，后来看说明书上讲外面直接加水就可以了！

• dragonkilly (2013-11-10 22:17:39)

  
  大家帮忙分析一下原因呀，我已经做了很久了，这样的结果太打击人了！

• xueyouzhang (2013-11-10 22:17:54)

  
  1。厚的滤纸用一层就好，我用的一层，没有问题。
  2。甲醇泡完之后在转膜液中的时间要长，甲醇没有泡干净的后果就是转膜之后带漂移，试一下甲醇5min,transfer buffer 1h。
  3。把小镊子的头用封口膜包一下，看你的第二张图，有印子不太好，尤其是不小心夹到你的目的带的时候。

• gogo (2013-11-10 22:18:15)

  看起来更象是在电泳的时候的问题

• dragonkilly (2013-11-10 22:18:36)

  电泳应该是没有问题的，倒是甲醇有可能是个问题，我记得原来我在甲醇只泡一会儿（PVDF膜还是白的，没有浸润），转出来的还可以，后来看了PVDF膜的使用说明书后就在甲醇中泡的时间延长至完全浸润；这次我试试看少用甲醇泡，多用缓冲液泡，还有用三层普通的滤纸试试。镊子的头我会注意的，再次谢谢suiguo！

• cwcwcww (2013-11-10 22:18:56)

  我用四层滤纸都没有任何问题
  
  我觉得再查一下曝光时候的红光和用的胶片
  看看有没有问题

• biabiade (2013-11-10 22:19:28)

  我一般都是直接泡了甲醇后，蘸一下转印buffer
  
  没什么问题啊！

• biabiade (2013-11-10 22:19:51)

  
  你可以用丽春红染膜看看，是不是膜上的条带就这么乱
  如果不是，那问题肯定出在你转膜之后
  如果没有丽春红也可以用R250染色

• fox_79 (2013-11-10 22:20:09)

  QUOTE:

  原帖由 biabiade 于 2013-11-10 22:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你可以用丽春红染膜看看，是不是膜上的条带就这么乱
  如果不是，那问题肯定出在你转膜之后
  如果没有丽春红也可以用R250染色

  同意上面的说法
  图都这样了，就不要来回曝光了。分析原因吧。
  建议你一步一步的来，先确定胶跑的好，如果确定了，再确定其他的。
  
  【1】先用考马斯兰染一下胶，看胶上的情况怎么样，如果胶上的蛋白就不好的话，就不要往下做了，先把电泳之前的事情搞明白。看你的图，问题出在哪里的可能性都有，但是我感觉电泳都没有搞好的可能性很大。所以强烈建议用考马斯兰染胶，看胶上的情况。
  
  【2】 如果胶上的蛋白经过染色之后发现挺好的，这样再转膜。然后用丽春红染色看膜上的情况，如果膜上的条带不好，就分析电泳和转膜之间的事情。如果膜上的蛋白是好的，那问题就出在转膜之后，这样查找问题点范围就缩小了。
  
  【3】滤纸的厚度适中就可以了。我用的是原装的滤纸，用一张。
  
  【4】现在我感觉要先确定问题出在哪里。确定了问题在哪里，这样就可以集中经历，研究问题出在哪里了。这样分析问题，意义估计大一些。问题容易解决一些。
  
  【5】染完胶和膜，把结果跟大家一说，大家也好分析。象现在这样大家也是只能猜，因为问题出在哪里的可能性都有呀。

• dragonkilly (2013-11-10 22:20:40)

  
  这是最近的图,同时跑两块胶,一块转膜,一块染色,染色显示电泳没有问题,膜用丽春红染过,背景上看不到水流一样的条带,但是抗体显色过后就不对了

  
  42836398.jpg

• dragonkilly (2013-11-10 22:21:00)

  
  这是转膜的图

  
  90102291.snap.jpg

• dragonkilly (2013-11-10 22:21:24)

  
  是不是海绵变薄的原因呢,我发现海绵的厚薄不均匀,厚度差别很大!所以所做的三明治夹层在minive的转印blot中显得有点松,不知道是不是这个原因?

• feima+ (2013-11-10 22:21:43)

  考虑一下更换膜。从别的实验室借一张膜试试。同时彻底清洁你孵育一抗和二抗的容器。

• wiwi (2013-11-10 22:22:06)

  
  电泳没问题，看来是转膜出错。
  
  1
  放三明治时仔细检查下绝对不能有气泡。
  2
  所用的海绵和滤纸应提前20－30min置于湿转液中浸泡。
  3
  三明治要夹紧了，以上夹板的时候用上50－70％的手劲儿为宜。
  4
  海绵一般不会出错的，尤其是你们实验室其他人用着没出问题的情况下，不过实在不行就考虑更换。
  5
  滤纸的厚度和层数没有定数。以达到夹紧三明治为宜。
  6
  膜的问题：PVDF只需要在甲醇中浸泡几秒钟就可以完全浸润，膜不再发白，你的膜怎么浸润这么慢？是不是甲醇有问题？要用纯甲醇，不带稀释的啊！
  
  我大胆的推测下：似乎是因为膜和胶之间局部有缝隙，蛋白从胶中电泳出来后弥散在缝隙中的缓冲液里，然后又被转移到膜上。或者膜没完全浸润，蛋白无法牢固附着。

• dragonkilly (2013-11-10 22:22:28)

  谢谢大家的帮助！问题解决了，是海绵用久了变薄了的原因，后来换过海绵就好了！