【求助】蛋白表达量极小是怎么回事啊?

最新回复

• 气泡 (2013-11-11 18:46:52)

  
  顺便说一句,我表达的两个蛋白都出现了这种情况,测序是正确的,我分别用PET28-A和PQE30载体表达的.

• woshituzhu (2013-11-11 18:47:14)

  
  lz是用E.coli表达的么？
  表达的蛋白会不会对E.coli有伤害或者被E.coli降解呢？
  也许可以试试不同的表达系统，比如yeast等等。
  
  新手的个人愚见~~

• tudou85 (2013-11-11 18:48:36)

  
  我曾经表达过一个核酸酶，SDS-PAGE看不到，采用Ni-柱浓缩后发现蛋白表达，量也非常少，而且细菌未诱导生长正常，诱导1小时后细菌OD值降低，细菌死亡。原因就是核酸酶有活性表达后，降解DNA使细菌死亡，蛋白也就很少了，突变无活性后表达正常
  
  如果LZ也遇到诱导后菌体死亡的现象，那么你的蛋白对细菌使有毒性，并有致死作用的，换表达系统或者改变表达条件

• 气泡 (2013-11-11 18:49:25)

  
  你的意思是表达的蛋白对大肠杆菌有伤害,那也不会影响它的表达量呀.而且我的蛋白不是核酸酶类的,这个蛋白国外己有人成功表达了,量也挺大,但是我却做不出来,不知道为什么原因,烦啊

• tudou85 (2013-11-11 18:49:47)

  
  表达对细菌有伤害的蛋白肯定会影响表达量的，要不就是包涵体。国外采用的是什么载体呢，也是你采用的这几种载体么？

• jujuba (2013-11-11 22:46:52)

  你可以试试低温诱导看看，有的蛋白需要低温14度20小时，才会出现。

• 气泡 (2013-11-11 22:47:31)

  
  相关疾病：
  头痛
  国外用的也是PET28,我表达的蛋白是细菌细胞壁表面的一种蛋白,对细菌应该是没有毒性的啊,低温诱导我也尝试了,反而比37度更小.真是头疼啊?不知道还有什么人为因素可以影响它呢?经我手表达的两个蛋白都出现了这种情况,别人也有做我一样的蛋白的,表达量却很大,真不知道原因出在哪里了?

• yysr238 (2013-11-11 22:47:50)

  
  是不是你跑电泳的问题，你可以换人家的阳性蛋白来跑电泳，看看是不是你后期处理跑电泳出了问题。可能是一些仪器，胶等客观的原因。
  同情你！祝你早日找到答案。

• 气泡 (2013-11-11 22:48:08)

  我在想是不是转化进去的质粒太少导致我的表达量小，于是又重新转化了一次，以前转化纯质粒我都转化１微升就够了，这次转了１０微升，可是表达出来的效果还是那样，难道是我一开始连接的时候就出了问题？不知道有没有懂这方面的高手，请帮忙

• 气泡 (2013-11-11 23:23:12)

  
  对了，我连接的时候，转化后每次都只长几个菌落，但挑出来有阳性的，我就用了．能不能跟感受态有关？

• HP007 (2013-11-11 23:23:40)

  
  你的细菌培养基是不是可以优化一下。总之多查文献一定会有办法的，好运。

• remenb (2013-11-11 23:24:07)

  
  既然是细菌细胞壁蛋白，您检查上清液。

• any333 (2013-11-11 23:24:34)

  
  如果国外已经有人表达过，你用的载体、菌株以及想要表达的蛋白质是完全一致的吗？如果是的，又怀疑克隆有问题的话，建议你在摸索的同时请求国外的实验室（第一个做出来）给你一些质粒。这可以节省时间。
  所有条件均一致的情况下，还是表达不出来，你也可以写信询问作者，他们使用了什么样的条件。发表文章后，他们有这个义务告诉你实验条件。当然也可能碰壁。但你也不损失什么。
  还有，你是用IPTG诱导前与诱导后的全菌株裂解液跑SDS-PAGE，发现对应分子量位置有表达增强，但很微弱吗？还是纯化后发现太少？
  如果有抗体的话，建议作个western blot。可以给那条微弱的细线定性，这样也不用怀疑质粒，全力投入改善表达条件。蛋白容易降解的话，37C诱导偏高，可以用34C，也有用15C低温诱导的。
  蛋白质表达时，本身的氨基酸组成也要考虑，Pro, Leu等太多都不好表达。选择载体或菌株时可以多查阅相关的资料。挑选到合适的载体和菌株可以事半功倍。

• vvmmoy (2013-11-11 23:25:00)

  我曾经表达过一个核酸酶，SDS-PAGE看不到，采用Ni-柱浓缩后发现蛋白表达，量也非常少，而且细菌未诱导生长正常，诱导1小时后细菌OD值降低，细菌死亡。原因就是核酸酶有活性表达后，降解DNA使细菌死亡，蛋白也就很少了，突变无活性后表达正常
  
  如果LZ也遇到诱导后菌体死亡的现象，那么你的蛋白对细菌使有毒性，并有致死作用的，换表达系统或者改变表达条件
  
  =====================
  
  突变无活性后表达正常.
  如何进行突变的?
  如何选择突变位点?
  谢谢.

• vvmmoy (2013-11-11 23:26:40)

  如果国外已经有人表达过，你用的载体、菌株以及想要表达的蛋白质是完全一致的吗？如果是的，又怀疑克隆有问题的话，建议你在摸索的同时请求国外的实验室（第一个做出来）给你一些质粒。这可以节省时间。
  所有条件均一致的情况下，还是表达不出来，你也可以写信询问作者，他们使用了什么样的条件。发表文章后，他们有这个义务告诉你实验条件。当然也可能碰壁。但你也不损失什么。
  还有，你是用IPTG诱导前与诱导后的全菌株裂解液跑SDS-PAGE，发现对应分子量位置有表达增强，但很微弱吗？还是纯化后发现太少？
  如果有抗体的话，建议作个western blot。可以给那条微弱的细线定性，这样也不用怀疑质粒，全力投入改善表达条件。蛋白容易降解的话，37C诱导偏高，可以用34C，也有用15C低温诱导的。
  蛋白质表达时，本身的氨基酸组成也要考虑，Pro, Leu等太多都不好表达。选择载体或菌株时可以多查阅相关的资料。挑选到合适的载体和菌株可以事半功倍。
  
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  回答精辟.
  现在有个疑问,蛋白质表达时候,氨基酸的组成使得其表达受阻不知有何方法克服.
  

• leifengta (2013-11-11 23:27:01)

  
  我想请教下，检测上清液的蛋白怎么检测呢？上清液是LB，检测需要浓缩吧？我做过一次，没有结果。现在非常想验证我的蛋白是不是分泌型的。可是苦于找不到方法。望各位高手指点。多谢了！

• finger (2013-11-11 23:27:29)

  QUOTE:

  原帖由 leifengta 于 2013-11-11 23:27 发表
  
  我想请教下，检测上清液的蛋白怎么检测呢？上清液是LB，检测需要浓缩吧？我做过一次，没有结果。现在非常想验证我的蛋白是不是分泌型的。可是苦于找不到方法。望各位高手指点。多谢了！ ...

  做硫酸铵沉淀，浓缩以后电泳检测

• finger (2013-11-11 23:29:35)

  我做的克隆表达目的片段与载体连接后酶切及PCR鉴定都是正确的,为什么表达量特别小呢,只见一条细线,大小应该是表达的融合蛋白,我优化过诱导时间,IPTG浓度,诱导温度但都无变化,我还换过几次载体,结果表达出来的效果都是一样的,到底是怎么回事啊?请求各位高手帮忙.
  
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  夏天菌生长的快，质粒拷贝数又可能会降低。可以试试从诱导前就低温培养。
  还有就是诱导前的OD值从0.2到2都可以，不知试试高浓度诱导，会不会改善
  这些工作的前提是你的重组菌确定有表达，测序结果必须是正确的

• nikun230 (2013-11-11 23:29:53)

  
  极有可能是表达的蛋白对宿主菌有毒害作用,不知道你用的引物是否也和别人的一样.有时候肽链稍有差异,性质就有很大区别.

• sunshine039 (2013-11-11 23:35:36)

  
  如果表达的蛋白有稀有密码子的话，可以换对应的宿主菌