【求助】纯化His-tag 蛋白 不同咪唑浓度梯度洗脱 蛋白电泳图

最新回复

• pou (2013-11-12 20:34:08)

  请大家帮助分析分析，不是应该在低咪唑浓度洗脱不下目标蛋白吗，而我的结果是都能洗出来，而100和200mM更多一些，并且有两个条带，很不解啊！谢谢大家了~

  
  52709274.jpg

• nikun230 (2013-11-12 20:34:42)

  QUOTE:

  原帖由 pou 于 2013-11-12 20:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  请大家帮助分析分析，不是应该在低咪唑浓度洗脱不下目标蛋白吗，而我的结果是都能洗出来，而100和200mM更多一些，并且有两个条带，很不解啊！谢谢大家了~ ...

  明显200mM的好啊，非特异性带明显少了很多了

• pou (2013-11-12 20:37:51)

  QUOTE:

  原帖由 nikun230 于 2013-11-12 20:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  
  明显200mM的好啊，非特异性带明显少了很多了

  我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
  而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？

• birdfish (2013-11-12 20:38:42)

  怎么看你这图好像反了

• birdfish (2013-11-12 20:39:26)

  用Ni sepharose 6 fast flow纯化His-tag 蛋白，刚开始做，先做了咪唑浓度梯度的优化，用了20，60，100，200，300mM的咪唑浓度洗脱，但看了蛋白电泳图，还是找不到合适的咪唑浓度，20-200之间都有目标蛋白和杂蛋白出现
  电泳跑的不好：????
  请大家帮助分析分析，不是应该在低咪唑浓度洗脱不下目标蛋白吗，而我的结果是都能洗出来，而100和200mM更多一些，并且有两个条带，很不解啊！谢谢大家了~
  
  你试一下先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子，降低一些非特异性吸附，然后重新梯度洗脱测试，如50，100，150，200，300mM看看

• birdfish (2013-11-12 20:40:55)

  我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
  而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？
  
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  前面杂蛋白都洗出来了，所以你200mM看上去相对较纯，先将样品调到咪唑浓度10mM左右，再重新进行梯度洗脱试试吧。

• xingyi08 (2013-11-12 20:42:11)

  先用10-20mM咪唑的缓冲液多洗洗，再洗脱

• pou (2013-11-12 20:42:44)

  怎么看你这图好像反了
  
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  呵呵，刚开始做不知道怎么算正怎么算反哦？
  应该是什么样的啊？

• pou (2013-11-12 20:44:43)

  你试一下先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子，降低一些非特异性吸附，然后重新梯度洗脱测试，如50，100，150，200，300mM看看
  
  ==========================================================================================
  
  是说进行二次纯化吗？
  还是说上样前先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子？做的时候上样前有用含10mM Binding Buffer 平衡过柱子

• pou (2013-11-12 20:46:38)

  先用10-20mM咪唑的缓冲液多洗洗，再洗脱
  
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  用10-20mM咪唑的缓冲液多洗了之后，直接用高浓度咪唑洗目标蛋白吗？

• njkph (2013-11-12 20:48:02)

  呵呵，刚开始做不知道怎么算正怎么算反哦？
  应该是什么样的啊？
  
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  把这图垂直翻过来才对

• njkph (2013-11-12 20:49:27)

  是说进行二次纯化吗？
  还是说上样前先用含10mM Binding Buffer 平衡一下柱子？做的时候上样前有用含10mM Binding Buffer 平衡过柱子
  
  ==============================================================================================================
  
  就是刚破完菌后，往样品里添加咪唑使终浓度为10mM左右。然后上样前柱子也要用含10mM咪唑Binding Buffer平衡一下，减少一些非特异性吸附

• 2541 (2013-11-12 20:49:47)

  
  不知道你最终要求多少的纯度的？
  
  个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。

• feima+ (2013-11-12 20:51:20)

  
  缓冲体系，pH及盐浓度
  对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。

• ero11 (2013-11-12 20:53:01)

  我刚开始做，也不是很懂，我是想200mM下还是有杂蛋白，这样纯化出来的蛋白不纯啊
  而且目标蛋白在60mM时就开始被洗下来了，这样正常吗？
  你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱

• pou (2013-11-12 20:53:35)

  不知道你最终要求多少的纯度的？
  
  个人觉得只靠一个NI柱请亲和的纯化几乎是不可能做到特别高的纯度的。
  
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  想在纯化之后做一下蛋白的Km值，最适pH，还有最适温度之类的表征
  做这些是不是需要很纯的蛋白呢？
  Ni柱纯化后的蛋白可以做这些表征吗？

• pou (2013-11-12 20:54:37)

  缓冲体系，pH及盐浓度
  对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如Tris-HCl等，适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加0.1-1M氯化钠，而在平衡缓冲液添加0.1-0.5%吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。
  
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  谢谢，我再调pH试试~
  感觉很难得到很纯的蛋白啊

• pou (2013-11-12 20:55:05)

  你在洗脱前，先用20mM咪唑的洗涤液洗2~3遍再用200mM的咪唑洗脱
  
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  嗯，好
  以前用的10mM，现在改成20mM的试试
  谢谢啦

• yhz1973 (2013-11-12 20:55:48)

  我感觉你蛋白挂柱有问题，挂的不多。