【求助】WESTERN结果无法重复的难题

字体: 小中大 | 打印发表于: 2013-11-12 22:09 作者: 彼岸花opp 来源: 分析测试百科网

一直在做WESTERN,以前目的蛋白（大小40kd/60kd)的显色都很理想。可是,本周以来样本再也没有结果。一抗、二抗都重新配置了，还是不行。并且膜用丽春红作了预染，转移效果还好。请问这是怎么回事?
我的考虑：1我们使用PBST洗膜的，今天测了一下ph似乎偏低，7.0左右，有影响吗？2蛋白的处理方面，我是将细胞用pbs洗2次后，2xSDS上样BUFFER收集样品，超声粉碎（其中产生了气泡，会有影响吗？），沸水煮10分钟，12000rpmX10m离心，去沉淀。有问题吗？蛋白会降解吗？可是一直以来我们实验室都是这样处理样本的。
实在不知道原因是什麽？难道一抗失效了！请各位高手帮忙分析一下吧！

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【求助】WESTERN结果无法重复的难题

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kswl870 (2013-11-12 22:09:57)

1. Positive control（以前成功detect过的样品）结果如何？如果ok的话，primary ab/PBST/etc.应该没问题，就是本批样品处理的问题吧？
2. 我以前遇到过的情况有一个就是 ponceau staining还ok，但是最后结果很差，最后不断实践发现，由于我run了胶之后，没有把胶以及membrane在transfer buffer里泡一段时间，就直接transfer去了（我用的是semi-dry法），这样做的结果是蛋白仿佛transfer到膜上去了，但是stay的不好，洗一段时间就掉了Smile, 因为能从molecular weight marker蓝色逐渐变浅看出来。后来改进之后效果超好。（这只是我自己遇到的情况，仅供参考）
3. PBST，T的含量请降低，通常是0.1%? 可降至 0.02%. 原因是，Tween20应该是detergent，可以帮助去掉background但是也会妨碍ab的binding吧？不过如果你一直都这么用，应该没啥问题了吧？
4. 如果想尽办法都不行，我重新自己配所有要用的buffer，调准pH。
mingming0638 (2013-11-12 22:24:31)

可能是，你的蛋白样本里没有蛋白酶抑制剂，蛋白降解，只剩下了蛋白骨架。所以后一次做不出来。也可能是，你才用的显色方法不行。可以改成超敏发光也曝光显色。
彼岸花opp (2013-11-12 22:26:01)

想问一下“把胶以及membrane在transfer buffer里泡一段时间“，大概是多长时间？我们做的是湿转，但是每次为了消除胶和membrane之间的气泡，都会用玻棒用力的擀，最后好像浸过的滤纸又变干了，这样会不会有影响呢？
wawa (2013-11-12 22:26:45)

首先，阳性对照是最好的原因查找方法：用以前出过结果的样本点几个泳道。同时作内参，也可起到一定的参考作用。

其次，怀疑Buffer的话，可以在ECl未出结果时，重新用丽春红预染，观看结果。以证实蛋白条带的存在与否。

另外，ECl最长时间曝光，一支到背景变灰，这样可以诊察浅条带。如果仍是一片白，高度怀疑二抗问题，下次可以更换抗体试试。
7437654 (2013-11-12 22:27:06)

“把胶以及membrane在transfer buffer里泡一段时间“

建议是15分钟。
glass (2013-11-12 22:27:45)

谢谢大家！
我们是用红外发光检测D!
目前已将以前做出结果的膜STRIPPING 后复染，没有结果！
SadSadSad
突然想起PBST如果是纯水+吐温会有影响吗？想了想除了PBST是实验室新来的配的，其余都已重新核实过了！
tangxin_80 (2013-11-12 22:28:11)

除了bluedragon的建议以外，还建议你用PBS洗膜，在冰浴下超声破碎（最好加入PMSF或EDTA等蛋白酶抑制剂），间隔时间最好是超声时间的2倍（有利于热量扩散）。
彼岸花opp (2013-11-12 22:28:34)

重新配置了pbs后问题解决了！看来试验处处都仔细！
mercedes (2013-11-12 22:29:07)

额外问一句,用PBST好还是TBST好?有人比较过么?
redbutterfly (2013-11-12 22:29:39)

知道你用半干转膜我好高兴啊，请问你半干转膜30-40KD的蛋白转膜时间和电压一般是多少啊，我用的是12V，12min，但是效果不好。我试了转8-13分钟，和15分钟，都只有12min的稍微好点，关键是现在不知道怎么回事连这个不好的结果我都重复不出来了，什么都没有变啊。下面是我12V,12MIN，上样量50ug跑出来的结果，第二张是内参。
redbutterfly (2013-11-12 22:30:16)

知道你用半干转膜我好高兴啊，请问你半干转膜30-40KD的蛋白转膜时间和电压一般是多少啊，我用的是12V，12min，但是效果不好。我试了转8-13分钟，和15分钟，都只有12min的稍微好点，关键是现在不知道怎么回事连这个不好的结果我都重复不出来了，什么都没有变啊。下面是我12V,12MIN，上样量50ug跑出来的结果，第二张是内参。每次内参都能跑出来，就是目的出不来啊，还请指教指教！

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nn255 (2013-11-12 22:30:39)

QUOTE:
原帖由 redbutterfly 于 2013-11-12 22:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
知道你用半干转膜我好高兴啊，请问你半干转膜30-40KD的蛋白转膜时间和电压一般是多少啊，我用的是12V，12min，但是效果不好。我试了转8-13分钟，和15分钟，都只有12min的稍微好点，关键是现在不知道怎么回事连这个不好的结果我都重 ...
上样太少。加大上样量，提高一抗浓度。