【求助】PET32a(+)原核表达无目的蛋白表达

最新回复

• babybabe (2013-11-13 14:45:02)

  右1 MARKER （下至上10KD，15 KD，25 KD，35 KD，40 KD，55 KD，70 KD，100 KD，130 KD，170 KD）
  余依次为
  诱导前：
  2 pet32a(+) 空载体 菌体
  3 pet32a(+) 空载体 上清
  4 pet32a(+)+目的基因 菌体
  5 pet32a(+)+目的基因 上清
  诱导后：
  6 pet32a(+) 空载体 菌体
  7 pet32a(+) 空载体 上清
  8 pet32a(+)+目的基因 菌体
  9 pet32a(+)+目的基因 上清
  
  目的蛋白约 102-106 KD

• yjf1026 (2013-11-13 14:45:28)

  
  我做过一个蛋白质是这种情况，目的蛋白质表达量很低，但却是包涵体表达。所以在全菌电泳时看不到目的蛋白质的表达，而菌体超声破碎后，沉淀中能够观测到目的蛋白质表达。用免疫印迹实验也证实了这一点。不知道你的蛋白质会不会属于这种特例？
  另外你在提到25KD 有一表达，有没有这种可能性：你的目的蛋白质是多聚体，单体为25KD

• yjf1026 (2013-11-13 14:45:53)

  
  最好做一下免疫印迹确认一下，再考虑换载体或者菌株

• IAM007 (2013-11-13 14:46:27)

  
  我也做过PET32的表达也没有和楼主类似的情况 目的蛋白在25KD处有表达 但是我目的蛋白的德分子量为40KD
  但是我PET32空载经诱导前后表达的很明显约在18KD左右

• gogo (2013-11-13 14:46:59)

  由原核载体PET32a(+)+目的融合基因（2.7Kb）构成载体，双酶切与连接测序结果都正确。经1mM ITPG诱导3--4h，好像无目的蛋白表达（诱导前后无差别），在25KD 有一表达，麻烦高手看一下，给于点提示，该如何下一步的实验，换载体，还是.............
  
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  个人觉得你的实验有问题，空载体表达上清应该有TRX的表达条带的；
  可现在没有，那你就要排除你实验出错的可能性；
  还有就是鉴定表达不一定要看上清的，只要看全菌对照就可以。
  再次你的这个胶的浓度和分辨率有待改进，看都看不清楚，怎么判断是否有表达，还有，100KD这么大的蛋白表达量不会很高，如果胶不好的话，根本看不出来的；
  要想能清楚的分辨，可以做下western看是否有条带，有的话，可以优化条件。
  个人觉得你现在首先确保实验没问题，然后把蛋白胶浓度降低，尽量跑好看点，然后做个wetern确认，确实没表达，建议换表达载体
  祝好运！

• any333 (2013-11-13 14:47:33)

  
  你表达是否是酶，如果是的话应该以酶活性为准，当然western也可以。
  
  我表达的很多蛋白都是SDS-PAGE检测不到，但有酶活性，用镍柱就纯化到了。