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【讨论帖】再谈 膜蛋白WB实验时 内参选择问题
【讨论帖】再谈 膜蛋白WB实验时 内参选择问题
如题,这是一个老问题了,但是还想跟大家讨论一下,因为我在园子里搜索了一下,以前的讨论没有得出一个让大家都满意的结论。
用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白之后,进行WB实验,是否可以用β-actin或者GAPDH等做内参?
先说说我的看法:
1、如果是提取的总蛋白,然后做WB,用β-actin或者GAPDH做内参肯定是没有问题的,这是公认的东西。
2、如果用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白,再用β-actin作为内参似乎不妥,因为理论上来讲β-actin在膜上是不表达的。WB能做出β-actin来是因为膜蛋白提取时把胞质蛋白也提出来了。然而,如果我们试验目的是用药物处理细胞,比较处理前后某种膜蛋白的表达情况,此时用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白后再用β-actin做内参似乎就不妥了,因为你根本不知道药物处理前后混杂了多少的胞质蛋白进来。如果没有胞质蛋白混进去的话,β-actin就是检测不到的。
3、是否可以用GAPDH?目前大家都认为他是跟β-actin一样的,既然β-actin不妥,那么GAPDH也不行啦。但是,我要说点自己的看法:在数据库里查了一下,发现GAPDH不止定位在胞质中,而且胞核和膜上都有!(见链接:cuturl('http://www.uniprot.org/uniprot/P04406'))这是不是说明了可以用GAPDH作为内参,虽然他并不单纯定位于细胞膜上,但至少在膜上有表达,起码比选用β-actin合理一些。
想听听大家的看法。另外,有没有其他更好的内参可以推荐一下。
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【讨论帖】再谈 膜蛋白WB实验时 内参选择问题
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最新回复
luoliqiong (2013-11-13 14:51:37)
其实这是一个很重要的学术问题,希望大家畅所欲言
用膜蛋白提取试剂盒提取蛋白之后,进行WB实验,用GAPDH做内参是否合适?如果不合适的话,到底有没有什么其他蛋白可以担当内参的角色?
tuuu2 (2013-11-13 14:51:58)
这个问题也一直困扰着我
同样还有胞外蛋白的内参问题。
等待高人出现解惑
NBA (2013-11-13 14:52:24)
同样困惑,期待高人指点!
vvmmoy (2013-11-13 14:52:45)
左心室心肌细胞冒失不表达 β-actin
wu11998866 (2013-11-13 14:53:06)
楼主的观点很正确,β-actin 和GAPDH 是肯定不能用的,貌似建议用“钠钾ATP酶离子通道蛋白”做内参的比较多。
BOSS2011 (2013-11-13 14:53:31)
内参没有公认的,根据实验不同,内参不同,内参的真正意义在于在你的样品中这种蛋白的含量相对固定,不受处理因素的影响。“不受处理因素影响”才是关键,如果你研究的是药物对细胞骨架的影响你也选用actin(公认?)。认识了内参的意义,才能选出合适的内参。
BOSS2011 (2013-11-13 14:54:21)
学习了,听我在国外实验室待过的师姐说,在国外实验室,做WB之前,要用其实验室所有的内参拿来做一个预实验,哪个内参表达稳定,就用哪个。有时候,管家基因真的不一定管家。
TAT (2013-11-13 14:54:39)
utt0989 (2013-11-13 14:55:05)
H2O (2013-11-13 14:55:32)
QUOTE:
直接做ELISA,如果有Kit的话。。。。。memory (2013-11-13 14:56:00)
有些人提取蛋白会选择胞浆、胞核分开提取,更细的还有膜蛋白什么的,不提取总蛋白,所以做内参要选择相应部位表达稳定的蛋白。实际情况中,任何一种试剂盒或自配的提取液,都不可能完全将胞浆、胞核蛋白等完全分离开,提取时总会有交叉污染。就是提取的核蛋白肯定会有beta-actin,而胞浆蛋白也会有核蛋白的存在,所以说用extraction比protein更为恰当。同样的,膜蛋白的制备过程也存在一样的问题。现在文献中对这个问题没有足够认识的人不在少数,同样多派意见依然存在,用“不很科学”的方法做内参也可能都能有结果,只是其存在是否足够合理,将来投稿是否有足够的说服力来“搞掂”审稿人而已。
据个人的了解,建议做各种蛋白时可供选择的内参,不妥之处请指出。
1). Cytoplasmic and whole extraction: 肌动蛋白actin , GAPDH、tubulin 等常用。其中actin也分为多种,好像是6种,各亚型组织分布是不一样的,在肌肉组织中的beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。平时最多见的还是用beta-actin了,但各位的研究对象不同,可能在选择时还是需要稍稍注意一下较为合适的内参。
2). nuclear extraction: 组蛋白Histone H1,核纤层蛋白laminA/B/C ,nucleoprin p62类的、caveolin、也还有人用c-Fos ,较少见。
3). membrane extraction: Na-K ATPase (一种整合膜蛋白)。
luoliqiong (2013-11-13 14:58:44)
有谁能提供点 做膜蛋白WB实验时 使用Na-K ATPase做内参的文献吗?让大家参考参考
jujuba (2013-11-13 14:59:05)
luoliqiong (2013-11-13 15:00:01)
QUOTE:
我用的是Fermentas的Proteo JET membrane protein extraction kit (#K0321),可以用来提取胞质蛋白和膜蛋白,但是我按照说明书操作完之后,发现这个kit提出来的膜蛋白浓度明显高于胞质蛋白,也不知道这样提出来的胞质蛋白能不能用。jujuba (2013-11-13 15:00:37)
luoliqiong (2013-11-13 15:01:29)
QUOTE:
刚提出来没几天,测了下浓度都在0.7mg/ml左右,WB正在做jkobn (2013-11-13 15:01:54)
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我要做好几个指标,大部分都没有kit呢。
即便有的有,买的也忒贵了……
jujuba (2013-11-13 15:02:17)
这样子啊,那浓度还可以啊,等你结果出来的话可以跟我说下不?如果好用的话我就试试!谢谢了!
gogo (2013-11-13 15:02:45)
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可以直接定上清总蛋白量,上一样的蛋白量的时候可以不用内参
finger (2013-11-13 15:03:27)
也有的是不用内参的,western时上同样量的蛋白
【讨论帖】再谈 膜蛋白WB实验时 内参选择问题