【求助】请大家帮忙分析下我的SDS-PAGE蛋白检测胶啊

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• dreaming (2013-11-14 21:29:30)

  QUOTE:

  原帖由 october7 于 2013-11-14 21:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我是按照TCA/丙酮沉淀方法，提取总蛋白用来跑双向的，跑双向之前，先用SDS-PAGE,检测了下蛋白质量，但是看到这张图，我不知道该怎么办，请大家帮忙分析下啊，图上的右边3个，为蛋白样品，右边第4为Marker泳道。为什么我的蛋白样品，就中 ...

  从marker来看，胶配的不好

• october7 (2013-11-14 21:30:01)

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  原帖由 dreaming 于 2013-11-14 21:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  从marker来看，胶配的不好

  为什么我的样品，就集中在一块呢？？不是应该分布的很开嘛？？？

• ffaa (2013-11-14 21:30:23)

  
  先配好胶，把marker跑好了，再来分析样品问题
  也就是一天工夫

• october7 (2013-11-14 21:32:21)

  QUOTE:

  原帖由 ffaa 于 2013-11-14 21:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  先配好胶，把marker跑好了，再来分析样品问题
  也就是一天工夫

  谢谢楼上各位，我胶重新跑了一遍，胶确实跑的不好了，但是其实我想知道的是，为什么我的全蛋白不是充满整个泳道呢？？仅仅就2-3条带呢？？是没有提出来？？还是中间降解？？还是跑出去了？？？这个是核心啊，请大家给给帮忙分析下啊 ，
  最右边是Marker，左二为全蛋白样品，为什么就3条带呢？

  
  40762626.jpg

• jiushikeshui371 (2013-11-14 21:38:53)

  
  可能的原因：
  1, 上样量太少
  2，蛋白降解

• october7 (2013-11-14 21:42:53)

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  原帖由 jiushikeshui371 于 2013-11-14 21:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  可能的原因：
  1, 上样量太少
  2，蛋白降解

  你好，是牛肉总蛋白啊 ，应该很多蛋白的吧

• pou (2013-11-14 21:43:35)

  
  提蛋白的时候保证整个过程都在冰上进行的了吗？测量的蛋白浓度是多少？ 跑SDS-PAGE时的上样量多大？

• october7 (2013-11-14 21:45:18)

  全部保证不好说啊，有的是要求室温溶解了，还有换样什么的，都是很快的事，从-20拿出来，一换就又直接-20了，并且离心时候要求都是6度或者15度呢

• pou (2013-11-14 21:50:36)

  
  中间的要求室温溶解对蛋白的降解影响到不大，你的这张图谱是不是用照相机照的，最好用扫描仪扫图，分辨率会高的多，从你的图上看，感觉你的蛋白好像降解了，你提出来测量的浓度达到多少？上传的这种图的上样量又是多少？

• october7 (2013-11-14 21:52:58)

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  原帖由 pou 于 2013-11-14 21:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  中间的要求室温溶解对蛋白的降解影响到不大，你的这张图谱是不是用照相机照的，最好用扫描仪扫图，分辨率会高的多，从你的图上看，感觉你的蛋白好像降解了，你提出来测量的浓度达到多少？上传的这种图的上样量又是多少？ ...

  恩，是用相机照得啊，我测出来浓度应该是1.1mg/ml，上样15左右了，你们蛋白提取时候，加什么样的蛋白酶抑制剂啊？？我就加了PMSF,不知道是不是这个原因啊

• october7 (2013-11-14 21:55:10)

  谢谢楼上的啊，我蛋白重新提了次，是这样的条带，没有高分子量的，这是怎么回事啊 。是降解吗》》还是高分子量的比较难溶解啊，还是肉样本身的问题啊 ？？中间是Marker，两边是样品，上样样品10，Marker5

  
  91183333.jpg

• pou (2013-11-14 21:55:45)

  QUOTE:

  原帖由 october7 于 2013-11-14 21:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  谢谢楼上的啊，我蛋白重新提了次，是这样的条带，没有高分子量的，这是怎么回事啊 。是降解吗》》还是高分子量的比较难溶解啊，还是肉样本身的问题啊 ？？中间是Marker，两边是样品，上样样品10，Marker5 ...

  你这里的上样是10ug还是10ul?不明白你说的，我们说的的上样量是指质量单位，不是体积单位，体积根据你们用的的梳子大小来的，但是上样质量单位是确定的，它有个有参考范围的，比如跑SDS-PAGE，我们一般在20-80ug之间的上样量，你可以参考下。

• october7 (2013-11-14 22:10:52)

  QUOTE:

  原帖由 pou 于 2013-11-14 21:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  你这里的上样是10ug还是10ul?不明白你说的，我们说的的上样量是指质量单位，不是体积单位，体积根据你们用的的梳子大小来的，但是上样质量单位是确定的，它有个有参考范围的，比如跑SDS-PAGE，我们一般在20-80ug之间的上样量，你可 ...

  上次是那个其实就是10ug左右了，我昨天又提了次啊看，浓度是3.8mg/ml，上样10ul,NI 你看看效果，给分析下啊，这次浓度提高是因为，裂解前，液氮研磨了下，且加了蛋白酶抑制剂（不知道是不是抑制降解的原因）， 不知道为啥高分子量蛋白依然依然很少，请大家分析下啊

  
  35710437.jpg

• pou (2013-11-14 22:11:36)

  QUOTE:

  原帖由 october7 于 2013-11-14 22:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  上次是那个其实就是10ug左右了，我昨天又提了次啊看，浓度是3.8mg/ml，上样10ul,NI 你看看效果，给分析下啊，这次浓度提高是因为，裂解前，液氮研磨了下，且加了蛋白酶抑制剂（不知道是不是抑制降解的原因）， 不知道为啥高分子量蛋白依 ...

  你这张图谱是上样时10ul,还是10ug?若是10ul的话，那上样量才达到2.6ug,第三条泳道是marker吗？

• october7 (2013-11-14 22:12:12)

  
  恩，是10ul啊，浓度是3.8ug/ul，上样量应该是38ug了，恩，第三条是Marker了，不过Marker，就上了5ul,所以有点弱啊，不知道前辈，对这个图，有什么看法啊？？对于缺少大分子量蛋白偶什么看法呢？大分量的，仔细看貌似也有，不过好弱啊？？

• october7 (2013-11-14 22:12:34)

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  原帖由 pou 于 2013-11-14 22:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  你这张图谱是上样时10ul,还是10ug?若是10ul的话，那上样量才达到2.6ug,第三条泳道是marker吗？

  恩，是10ul啊，浓度是3.8ug/ul，上样量应该是38ug了，恩，第三条是Marker了，不过Marker，就上了5ul,所以有点弱啊，不知道前辈，对这个图，有什么看法啊？？对于缺少大分子量蛋白有什么看法呢？大分子量蛋白的，仔细看貌似也有，不过好弱啊？？

• pou (2013-11-14 22:13:05)

  你是不是经过什么超滤之类的把高丰度的蛋白给滤过了，如果没有的话，也有可能你这个里面的高分子量的蛋白本身就很少，都是有可能的，你去做快7cm的小胶条的双向看看

• october7 (2013-11-14 22:14:06)

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  原帖由 pou 于 2013-11-14 22:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  你是不是经过什么超滤之类的把高丰度的蛋白给滤过了，如果没有的话，也有可能你这个里面的高分子量的蛋白本身就很少，都是有可能的，你去做快7cm的小胶条的双向看看 ...

  谢谢啊 ，倒是没有超滤，样品是牛的肌肉蛋白，我在考虑是不是大分子量蛋白容易降解，先降解了呢？？双向倒是了跑了次，电压上不去，预设4000V,只能达到2000V，在考虑丙酮沉淀除盐呢，双向图上也是缺少大分子量的啊 ，跑的很难看，就没上图啊，需要的话，我把图上上。