【求助】TCA/丙酮沉淀，蛋白为什么不溶呢？？

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• greenbee (2013-11-14 22:17:15)

  QUOTE:

  原帖由 耗子=== 于 2013-11-14 22:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  大家好，我用0.2%DTT,10%TCA的丙酮溶液沉淀蛋白后，为什么蛋白就是不溶呢？？一直是离心后的那种块状，不能被溶解开啊，大家知道是什么原因吗？？我的裂解液成分是：9M尿素，1%DTT,4%CHAPS,0.2%CA,沉淀后干燥12分钟，室温溶解了6个小时候， ...

  加一点NAOH就可以了 很快就会溶的

• 耗子=== (2013-11-14 22:17:48)

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  原帖由 greenbee 于 2013-11-14 22:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  加一点NAOH就可以了 很快就会溶的

  这样是不是引入了，新的离子啊 ，会影响双向吧

• greenbee (2013-11-14 22:18:24)

  用0.2M 的NAOH 根据沉淀的量加几ul就可以了 影响不大 我有的样品要调pH 100ul样品中加0.5M NAOH 1ul对IEF没有影响 你可以根据你的样品摸索一下

• bluelake (2013-11-14 22:18:46)

  
  没有为什么，就是溶不了。尤其不能等丙酮干了再加裂解液，坚决不能溶
  如果跑双向，建议超声助溶
  如果酶解，就直接加酶吧
  所以去盐之类的，如果能够超滤就不要沉淀

• pou (2013-11-14 22:19:07)

  
  是不是干燥过分了，这个也会影响溶解的？室温溶解6小时，这个时间也太长了。此外你的Urea的浓度偏高了，最好是9M以下，或者是尿素和硫脲一起使用也行，因为高浓度的尿素很容易析出结晶的

• 耗子=== (2013-11-14 22:19:32)

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  原帖由 pou 于 2013-11-14 22:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  是不是干燥过分了，这个也会影响溶解的？室温溶解6小时，这个时间也太长了。此外你的Urea的浓度偏高了，最好是9M以下，或者是尿素和硫脲一起使用也行，因为高浓度的尿素很容易析出结晶的 ...

  谢谢啊，请问你们提取时候都加硫脲了吗？？

• greenbee (2013-11-14 22:20:22)

  尿素和硫脲联用的话一般收7M尿素 2M硫脲

• 耗子=== (2013-11-14 22:20:53)

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  原帖由 greenbee 于 2013-11-14 22:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  尿素和硫脲联用的话一般收7M尿素 2M硫脲

  这个可以加，也可以不加，若两个都加的话，就用7M Urea和2M Thiourea,若是单独使用的话，就用8M Urea就可以了，不要超过9M，不然尿素很容易析出结晶

• 耗子=== (2013-11-14 22:21:18)

  恩，谢谢啊，不过我没换裂解液提出来了啊 ，我在另一个帖子上，给你上图啊，这个也上张吧，你看看这个效果怎么样啊 ，我就是把那个丙酮沉淀物，重新用液氮研磨，然后裂解，浓度达到4mg/ml了，不知道这个图是不是什么不足啊，请给评价下啊

  
  38284322.jpg

• 耗子=== (2013-11-14 22:21:40)

  这分别是又重新提了两次，浓度是提高了，只是下面这个是液氮研磨溶解，上面那个是剪碎溶解了，不知道你们有什么看法啊

  
  59769372.jpg

• pou (2013-11-14 22:22:20)

  
  液氮研磨蛋白溶解的更充分些，这是肯定的了，你说你用9M尿素，也提出了蛋白，但是这个不能就此说明这个浓度就一定可行，有可能会影响你后面的聚焦，有可能，我说过，这个浓度高的话，会析出结晶，影响聚焦。

• 耗子=== (2013-11-14 22:22:53)

  QUOTE:

  原帖由 pou 于 2013-11-14 22:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  液氮研磨蛋白溶解的更充分些，这是肯定的了，你说你用9M尿素，也提出了蛋白，但是这个不能就此说明这个浓度就一定可行，有可能会影响你后面的聚焦，有可能，我说过，这个浓度高的话，会析出结晶，影响聚焦。 ...

  恩，明白了，我下次就用8M的尿素啊，谢谢前辈指点啊 ，不知道液氮研磨那个蛋白块，会不会造成蛋白的降解，或者其他的什么影响啊？？？？？

• pou (2013-11-14 22:23:17)

  
  液氮研磨不会造成蛋白的降解，对后续的实验基本没有影响，放心去用吧

• dodoit (2013-11-14 22:23:48)

  
  请问一下LZ 是用什么BUFFER溶解的呢

• 耗子=== (2013-11-14 22:24:38)

  液氮研磨不会造成蛋白的降解，对后续的实验基本没有影响，放心去用吧
  
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  谢谢啊，另外请问下，我这缺少高分子量蛋白，不知道前辈认为是什么原因啊 ？？这是牛的肌肉蛋白

• 耗子=== (2013-11-14 22:25:00)

  请问一下LZ 是用什么BUFFER溶解的呢
  
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  你好啊，就是常用的那种啊，8M尿素（有时候也用9了），4%CHAPS,0.2%CA,1%DTT,蛋白酶抑制剂，pmsf什么的