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【求助】请教明胶酶谱的条带？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-11-15 11:19    作者: TAT    来源: 分析测试百科网

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【求助】请教明胶酶谱的条带？

小弟前天用明胶酶谱法测了MMP2的活性，但跑出来条带不是在深蓝色背景上的无色清晰酶谱条带，而是不知为什么啊？，我把主要步骤写在上面，请大家帮忙找出问题所在，谢谢！
1. 以无血清DMEM培养CMC细胞（帖壁生长），在相应时间点取培养上清离心后去除细胞，置于－20度冰箱备用。
2、明胶酶谱法检测MMPs的表达及活性
（1）明胶溶液配制 称取明胶，加入三蒸水，然后置于65°C水浴，在10min之内溶成均匀的液体，最后定容至终浓度1mg/ml，于4°C备用。
（2）SDS-PAGE胶的灌制 灌制10%SDS-PAGE胶，其中加入1mg/ml的明胶溶液，使明胶终浓度为0.1mg/ml。
（3）电泳 上清与4×上样缓冲液以3：1混匀，加入10%分离胶，80mA电泳1.5-2小时，至溴酚兰达到末端。
4×上样缓冲液: Tris-HCl(PH6.8) 0.4M
SDS 5%
Glycerol 20%
Bromophenol blue 0.03%
（4）2.5%Triton X-100清洗 胶置于100ml洗脱液中，摇床震荡80分钟，以洗脱SDS，使蛋白质复性，每20分钟更新一次洗脱液。
洗脱缓冲液： Tris-HCl [pH 7.5] 50mM
CaCl2 5mM
ZnCl2 1μM
Triton X-100 2.5% (v/v)
（5）孵育 胶置于100ml孵育缓冲液中，于37°C水浴缓慢震荡孵育34小时。
孵育缓冲液： Tris-HCl（pH7.5） 50mM
NaCl 0.2M
CaCl2 5mM
ZnCl2 1μM
Brij-35 0.02%
Sodium azide 0.2mM
（6）染色 将充分孵育后的胶以双蒸水漂洗2分钟，然后置于0.25%的考马斯亮蓝R250染液中，放在平缓摇动的摇床上于室温染色2.5小时。
考染液： Methanol 45%
Acetic acid 10%
Coomassie R blue 0.25%
（7）脱色 将染色后的胶置于脱色液中，放在平缓摇动的摇床上于室温脱色，每30分钟更新一次脱色液.
但最后的结果如图所示，郁闷加不解，是不是因为考染的时间过长？有的文献说染30分钟就可以了。
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  • kewanqi2011 (2013-11-15 11:20:38)


    一、制胶
    制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，含0.1％明胶的8％分离胶，5％堆积胶
    1 选择两块玻璃板（注意厚度1.0mm or 0.75mm）仔细夹好，装在支架上，并固定好。
    2 配制separating gel (10ml,两块)
    明胶溶液(0.1g/66ml) 6.6ml
    40% Acrylamide 2ml
    3M Tris-HCl (PH 8.8) 1.25ml
    10% SDS 0.1ml
    10% APS 75ul
    TEMED 10ul
    混匀后，倒入两块板中，上压1ml dd-water，静置30min~1hr(天气热时胶凝固快，冷时慢)，待肉眼可见胶与水之间有水平线存在时，将水倒出，准备灌制stacking gel。
    3 配制stacking gel (5ml,两块)
    dd-water 4.1ml
    40% Acrylamide 0.47ml
    2M Tris-HCl (PH 6.8) 0.31ml
    10% SDS 0.05ml
    10% APS 75ul
    TEMED 10ul
    充分混匀后，倒入板内，插上梳子（注意：防止梳子与胶之间残留气泡），静置30min或更长。
    样本与RIPA及5*LB混匀后，准备上样。（注意：无需95℃煮5～6min变性）。
    三、电泳Running buffer
    条件：室温80v；时间约2~2.5hr。
    四、洗脱
    电泳结束后，凝胶置于洗脱液中洗脱2次，每次45min。
    五、漂洗
    漂洗液漂洗2次，每次30min。
    六、孵育
    凝胶置于孵育液中37℃孵育18h。
    七、染色
    孵育结束后经考马斯亮蓝染色液染色3hr。可显示出MMP-2和MMP-9位于蓝色背景上的透亮带。
    八、脱色
    脱色液A(15-20min)、B(15-10min)、C(5-10min)
    A液 B液 C液
    甲醇 60ml(30%) 40 ml(20%) 20ml(10%)
    乙酸 20ml(10%) 20 ml(10%) 10ml(5%)
    去离子水 120ml 140ml 170ml

    应用复日FR-980生物电泳图象分析系统在灰阶模式下扫描电泳凝胶，并分析MMPs活性条带灰度密度值。
    配液
    (1)  匀浆缓冲液(RIPA) pH 7.0
    Tris-HCl 工作浓度1mol/L
    NaCl 0.5mol/L
    (2)  样本缓冲液(5*LB, 100ml) pH 8.0
    Tris 4.86g(0.4M)
    SDS 5.0g (5%)
    甘油 20ml(20%)
    Bromophenol blue 30mg(0.03%)
    (3)  洗脱液 1L pH7.6
    Triton X-100 25ml (2.5%)
    Tris-HCl 6.06g (50mmol/L)
    CaCl2 0.56g (5mmol/L)
    ZnCl2 0.136g(1μmol/L)[应用浓度为10nmol/L的ZnCl2贮存液，加100ul]
    (4)  漂洗液 1L pH7.6
    Tris-HCl 6.06g (50mmol/L)
    CaCl2 0.56g (5mmol/L)
    ZnCl2 0.136mg(1μmol/L)
    (5)  孵育液 1L pH7.6
    Tris-HCl 6.06g (50mmol/L)
    CaCl2 0.56g (5mmol/L)
    ZnCl2 0.136mg(1μmol/L)
    Brij-35 0.2g（0.02%）
      考马斯亮蓝染色液（200ml）

    考马斯亮蓝R-250 0.1g
    甲醇 60ml
    乙酸 20ml
    加去离子水 至 200ml
    (7)  脱色液A、B、C
    A液 B液 C液
    甲醇 60ml(30%) 40 ml(20%) 20ml(10%)
    乙酸 20ml(10%) 20 ml(10%) 10ml(5%)
    去离子水 120ml 140ml 170ml

  • kewanqi2011 (2013-11-15 11:21:02)

    你的图感觉是普通蛋白电泳后考马染色图,我也说不好你结果的原因，但应该不是考马的关系，我们也是这么长时间的染色的。
    染色的条带该是蛋白条带吧,是否蛋白已没有活性了?正常情况应该是兰色背景上的透明条带，而不是深色条带!

  • tangxin_80 (2013-11-15 11:21:25)


    我觉得你的明胶有问题。步骤没什么问题，主要就是蓝色本底太浅了，不太对劲。

    建议明胶要用进口的粉末状态的为好，孵育液中叠氮化钠加不加问题不大。不过建议孵育时间最好延长一些，并且取鼠肾匀浆最为阳性对照。

    2-ME，EDTA等抑制mmp的东西绝对不可以添加，整个过程要温和，尽量低温操作，包括跑胶。PMSF作为蛋白酶抑制剂是唯一可以使用的，并且加入后效果会很好。

  • zsxan1990 (2013-11-15 11:21:49)


    还有一点忘说了，我听了一个师姐建议，把我的样品和上样缓冲液混合后放在37度水浴了20分钟，这对会不会使酶活性失活而导致最后的条带像蛋白条带呢？

  • kewanqi2011 (2013-11-15 11:22:16)

    还有一点忘说了，我听了一个师姐建议，把我的样品和上样缓冲液混合后放在37度水浴了20分钟，这对会不会使酶活性失活而导致最后的条带像蛋白条带呢？

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    不知道你这样操作处于什么目的，因为检测蛋白活性,所以应尽量避免蛋白变性,我们一般都要求冰上操作,电泳也放在冰水里进行的。
    我作过HSC培养上清的酶谱,收集后离心后直接使用的，没有浓缩，活性很强的,我贴的图即是细胞培养上清的结果.
    你再重复一下吧，祝你好运·！

  • TAT (2013-11-15 11:22:42)


    再请问下几位战友，我那块胶左边marker从下往上数第2，3条带分子量分别为66，45KD，在这个位置出现条带是不是大概为64KD呢？我用上清变性后做WB后结果也是在差不多这个位置检测到的，那它酶活性是不是也应该在这个位置出现负染带呢？而我看见文献做和我一样的细胞上清实在72KD处检测到的，而我这个在72KD处什么都没见到，这是为什么呢？而看其他战友还有在92KD处出现负染带的，我就搞不懂了，这是怎么回事啊？请赐教

  • remenb (2013-11-15 11:31:12)


    原因是这样，明胶酶谱的蛋白样品是不完全变性的，因为并没有煮沸的过程，所以可能由于变性不充分的原因导致其分子量部位不同。还有可能就是不同来源样品蛋白的mmp分子量本来就有微小区别，要么就是由于明胶的质量原因导致的。总之明胶酶谱的分子量参照差不多就可以了，不可能太准。

  • xue258 (2013-11-15 11:31:34)


    请教一下上清浓缩了没有，怎样浓缩的？如何定量，DMEM是否对定量有影响？

  • gogo (2013-11-15 11:31:52)


    我买的MARKER是粉末制剂,说明书上说要变性后用,样品需要变性么?

  • gogo (2013-11-15 11:34:56)


    是灌了分离胶就要压水么?胶还没凝的时候我滴水进去结果水和胶融合了,胶快凝的时候立刻灌又起不到作用了,胶象锯齿一样

  • 831226 (2013-11-15 11:35:32)

    2、明胶酶谱法检测MMPs的表达及活性
    （1）明胶溶液配制 称取明胶，加入三蒸水，然后置于65°C水浴，在10min之内溶成均匀的液体，最后定容至终浓度1mg/ml，于4°C备用。
    （2）SDS-PAGE胶的灌制 灌制10%SDS-PAGE胶，其中加入1mg/ml的明胶溶液，使明胶终浓度为0.1mg/ml。

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    明胶的储存浓度为1%，终浓度为0.1%。1mg/ml这一浓度是千分之一，即0.1%，而0.1mg/ml则为0.01%。所以问题在于明胶的浓度配错了。
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