【求助】pET-32(a)蛋白表达的大小

最新回复

• BOSS2011 (2013-11-16 10:31:37)

  
  融合蛋白54K么？pET32a表达的是Trx融合蛋白，从Trx第一个ATG开始，另外SDS-PAGE检测的是大致分子量，误差较大

• zhenxin (2013-11-16 10:31:57)

  表达的是融合蛋白。所以比你目的蛋白量大，是正常的。
  你可以看看你的空白载体诱导后的电泳对照，会有一条带，加上你的目的蛋白的量就是你表达的融合蛋白的量了。

• 89tongzijun (2013-11-16 10:32:18)

  
  pET-32载体在多克隆位点前面就有几个TAG，如果您是在多克隆位点内部直接插入片段应该得到比你的目的片段要大的融合蛋白，空载体的时候好像表达大概20.4KD左右的融合标签（Trx Tag+S Tag+His Tag).
  另外，使用SDS-PAGE电泳，变性的时候由于SDS的作用，可能会有接近5KD左右的变化，那是正常的。具体的您可以找一下园子里面的帖子，有论述的。

• zhenxin (2013-11-16 10:32:36)

  
  谢谢各位XDJM的指点，那我的蛋白应该就是表达的了！

• 8princess8 (2013-11-16 10:33:00)

  pET-32载体在多克隆位点前面就有几个TAG，如果您是在多克隆位点内部直接插入片段应该得到比你的目的片段要大的融合蛋白，空载体的时候好像表达大概20.4KD左右的融合标签（Trx Tag+S Tag+His Tag).
  另外，使用SDS-PAGE电泳，变性的时候由于SDS的作用，可能会有接近5KD左右的变化，那是正常的。具体的您可以找一下园子里面的帖子，有论述的。
  
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  收集菌体后加1×SDS上样buffer煮沸得时间长短对蛋白质的大小有没有影响啊？根据分子克隆上说得一般是煮沸3－5分钟。
  
  [ 本帖最后由 8princess8 于 2013-11-16 10:34 编辑 ]

• ero11 (2013-11-16 10:34:40)

  
  相关疾病：
  短指
  这个我就不好说啊，你说的长短指的大概范围是多少呢？我个人试过的只在10分钟之内，基本不会有太大的变化。但是二硫键多的蛋白除外。越容易形成聚合体的蛋白，我一般都会久一点，不过最久也没有超过10分钟。因为即便是聚合体，高温10分钟我认为已经有足够能力去裂键了。

• kswl870 (2013-11-16 10:35:05)

  
  二硫键多的蛋白, 煮2-3分钟

• wu11998866 (2013-11-16 10:35:24)

  
  你可以把电泳图贴上来给大家看看，再进行分析一下。
  从你的表述来看应该是你的目的蛋白已经表达出来了。

• am10 (2013-11-16 10:35:45)

  
  那如果要计算PET32A表达的的融合蛋白的话,是不是就是从TRX.TAG的ATG开始就算呀?

• idoww (2013-11-16 10:36:07)

  
  有两个地方有HIS标签，如果不算后面的HIS标签，前面的TRX+HIS
  +S tag一共多大啊