【求助】蛋白表达

最新回复

• utt0989 (2013-11-16 10:43:26)

  
  我也遇到了相同的问题，我的蛋白还要小点，不过无论 怎样也诱导不出来 ，如果找到了诱导不出来的原因 ，麻烦分享一下

• hot_hot_hot (2013-11-16 10:43:43)

  
  IPTG失效了吗？尝试换个感受态细胞，或载体。

• wawa (2013-11-16 10:44:04)

  EGFP不是一种荧光报告基因么？楼主为何要构建原核表达质粒呢？
  
  而且100kD的蛋白有些偏大，原核表达系统要表达如此大的蛋白是很困难的。
  
  我见过的表达出来的最大的原核蛋白是94kD

• 8黑眼圈8 (2013-11-16 10:44:27)

  QUOTE:

  原帖由 wawa 于 2013-11-16 10:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  EGFP不是一种荧光报告基因么？楼主为何要构建原核表达质粒呢？
  
  而且100kD的蛋白有些偏大，原核表达系统要表达如此大的蛋白是很困难的。
  
  我见过的表达出来的最大的原核蛋白是94kD ...

  
  是的，我主要是将我的目的蛋白和EGFP融合后，观察荧光情况。因为如果目的蛋白是可溶的话，那么就会有荧光产生。我们实验室在做原核表达时最大的表达了300KD的蛋白，大小应该不是问题吧，呵呵.....

• 8黑眼圈8 (2013-11-16 10:44:46)

  QUOTE:

  原帖由 hot_hot_hot 于 2013-11-16 10:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  IPTG失效了吗？尝试换个感受态细胞，或载体。

  PTG应该没有失效，因为我做过平行实验，表达其它蛋白时没问题。、
  
  感受态BL21（DE3)pLysS是比较好的宿主菌，一般没问题，可能需要更换载体，但是也不知道该换什么载体？那样载体更适合膜蛋白的表达？

• fei1226com (2013-11-16 10:45:06)

  
  会不会是读码框发生改变了？

• hot_hot_hot (2013-11-16 10:45:29)

  尝试把目的片段截短一些，试试

• 33号 (2013-11-16 10:45:47)

  
  看看原核表达手册。上面东西的很全面。

• 8黑眼圈8 (2013-11-16 10:46:15)

  会不会是读码框发生改变了？
  
  ========================================================================
  
  谢谢啊，读码框应该不会错，我用的是NdeI 和HindIII酶切连接的，从起始密码开始翻译的。

• 8黑眼圈8 (2013-11-16 10:46:32)

  尝试把目的片段截短一些，试试
  
  ======================================================================================================
  
  我表达是一个膜蛋白的胞外部分，是经过裁断的，不过也还可以试试再裁断。估计问题是表达载体需要更换或者摸清诱导表达条件！

• 8黑眼圈8 (2013-11-16 10:46:53)

  看看原核表达手册。上面东西的很全面。
  
  =================
  
  嗯 目前也正在看呢。

• youyou99 (2013-11-16 10:47:12)

  
  如果已经胞外区，而且已经截短了，那再进行截短时就要参照一些文献了，别把所需功能区截了。
  
  更换载体和表达宿主菌也可以尝试一下。

• 8黑眼圈8 (2013-11-16 10:47:41)

  
  谢谢啊，我查了该蛋白的结构域，理论上胞外区就是我所构建的，具体到下一步我要研究蛋白与蛋白间的相互作用时，其特异性结合位点只有几百bp。目前在尝试更换载体。

  QUOTE:

  原帖由 youyou99 于 2013-11-16 10:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  如果已经胞外区，而且已经截短了，那再进行截短时就要参照一些文献了，别把所需功能区截了。
  
  更换载体和表达宿主菌也可以尝试一下。

• nn255 (2013-11-16 10:47:59)

  楼主的和GFP连接的方式我们实验室也做过。不过100K还是一个不小的蛋白，呵呵，我觉得目前还是裁断一截之后再试试，因为好多载体都是为了标签和融合表达都加了很多东西，你的蛋白再加就更大了啊

• 8黑眼圈8 (2013-11-16 10:48:23)

  QUOTE:

  原帖由 nn255 于 2013-11-16 10:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  楼主的和GFP连接的方式我们实验室也做过。不过100K还是一个不小的蛋白，呵呵，我觉得目前还是裁断一截之后再试试，因为好多载体都是为了标签和融合表达都加了很多东西，你的蛋白再加就更大了啊 ...

  是啊，目的基因本身有2000bp，在加上linker（90bp）与EGFP（717bp）就更大了。

• 66+77 (2013-11-16 10:48:40)

  我知道问题了，你用ndei切了，你看看你的第一个aa是什么；原核表达宝典上面说过了，如果把第一个aa是某些特殊的aa的话，会很容易被细菌降解，所以你可能要重新设计一下引物，在前面加上一个不会影响你荧光蛋白结构的aa；