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【求助】是二抗导致的背景高不？
请各位高手帮我指点指点：【求助】是二抗导致的背景高不？
最近做了两个蛋白的印记，一个actin 、一个目的蛋白
一抗 都是santa cruz的
二抗 皆是北京中衫 actin是羊抗兔、目的蛋白是兔抗山羊
两个蛋白是同时转膜（因为actin的条件没那么苛刻，就跟随目的同一块胶做了），同时抗体孵育，同时曝光，同时洗膜10min
结果，actin爆出来的条带非常漂亮，几乎没什么背景，而目的条带的膜就通体发亮，条带几乎看不到，想了好多方法去解决，没能爆出好看的条带，这两个蛋白，就是在二抗上不一样，难不成是 二抗的特异性不高
有没有这个可能？？
请做过的支招
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最新回复
kewanqi2011 (2013-11-17 16:47:42)
也有可能是一抗的问题，建议换一个一抗看看，或者找santacurz公司
hustwb (2013-11-17 16:48:03)
1.actin是单克隆，纯化很好，特异性强，所以条带很好
2.目的蛋白可能是多抗，特异性不强，非特异性结合较多，纯化也不及actin好，所以条带不佳
近来中杉的SANT CRUZ的抗体普遍存在这个问题，我们整个实验室都是这种情况
3.建议更换一抗，单克隆的效果会好一些
NBA (2013-11-17 16:48:38)
QUOTE:
好多天前就支过招了，看《实战指南》。2L你最好也去读读，明显是他的抗体稀释液配方不对；不要再纠缠什么封闭液了。
3L 单抗多抗都可能黑板，如果效价不高，其粘附效果是一样的，都可能黑板。actin唯一的好处是丰度高，所以在碰撞粘附的过程中，竞争优势太明显。也因为丰度高，制备抗体相对容易，本来非特异就低。
vtongli (2013-11-17 16:48:59)
douding66 (2013-11-17 16:49:39)
QUOTE:
看了你写的东东真是佩服，我反思到，我的细胞蛋白使用的提取直接就吸弃完全培养液没用pbs洗即提取总蛋白了，目的蛋白含量不高，照你的分析应该里面含有着高浓度的BSA，在一抗孵育的过程中，BSA与目的蛋白的一抗竞争而非特异性结合，从而导致整膜都亮，可是在这里我有个问题：BSA在细胞总蛋白总，他也是有一定的分子量的，通过SDS-PAGE电泳，他难道不能拉成一条直线，反而搞得整张膜亮亮的，来干扰目的蛋白的显现吗？这该如何理解呢？NBA (2013-11-17 16:50:12)
QUOTE:
晕！我不清楚怎么理解到BSA导致你整张膜亮的；我是在告诫某些研究的蛋白刚好是50KDa附近的人，它容易出现一条很浓的BSA显影的杂带。同样道理适用于其他，任何可能高丰度（内源或外源）的任意蛋白。你的问题，我专门分析过白板和黑板。你的抗体适用黑板的情况，首先可能抗体不太好，其次你用的封闭蛋白不适用你的抗体，你必须更改稀释液配方，等你按照我的说法改完了，再来判断到底是不是抗体的问题。
“2.WB结果白板（无信号）和黑板（高背景）。从抗体孵育角度解释白板和黑板问题（当然也可能与ECL显影有关，此点下一节有阐述），白板主要是可能是抗体本身效价不高，或者抗体稀释液中封闭蛋白过多，竞争结合时封闭蛋白完全挤掉了特异性的一抗，特异性条带和非特异性背景同样结合强度——无信号。黑板，也主要是因为抗体效价不高，而抗体稀释液中封闭蛋白的拮抗作用又没有完全发挥，此时无法有效识别抗原的一抗会等效的粘附转印膜的任何位置，显影后整张膜全黑。
有时候膜接近全黑，但可以若有如无的观察到靶蛋白，出现问题的原因虽然仍是抗体效价不高，封闭蛋白不能完全起到作用，不过此时可以通过改变抗体稀释液的配方，提高特异性和非特异性结合的信号差异，降低背景。”
“目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？——这下配方无限多了吧。
1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根据实际情况改变（若出现白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加）。gelatin大家可能比较陌生，不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方，你会发现很多抗体溶液里都有它。
2.很多情况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA时，gelatin浓度不能无限提高（会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，导致白板），BSA的浓度较随意。
3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST，也可用高盐浓度的缓冲液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切记，有的抗体对盐浓度敏感，包括构象和溶解度，因此需要尝试。
如果以上策略仍然无法解决高背景，可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料（新的）放在一起孵育个把小时再用。如果还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。”
去买gelatin，用gelatin封闭膜；把抗体稀释在gelatin/TBST里面，我估计要用gelatin+BSA的复方。
PPT (2013-11-17 16:50:38)
2L你最好也去读读，明显是他的抗体稀释液配方不对；不要再纠缠什么封闭液了。
3L 单抗多抗都可能黑板，如果效价不高，其粘附效果是一样的，都可能黑板。actin唯一的好处是丰度高，所以在碰撞粘附的过程中，竞争优势太明显。也因为丰度高，制备抗体相对容易，本来非特异就低。
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我细看了下，他的目的蛋白是羊抗的，而我做了几次羊抗，也是这个效果，不知道学长做羊抗有什么具体的心得
NBA (2013-11-17 16:51:07)
QUOTE:
鼠抗、兔抗、羊抗或者驴抗等等都一样。只是每一种抗体，不同公司的，甚至同一公司不同批次的（尤其几个经常转包别人实验室自制品的公司）都不一样，自己去摸索抗体稀释液的配方吧，没别的更好的办法；要么就是买贵点品质有保证的公司的bangqi_k (2013-11-17 16:51:44)
QUOTE:
老大你好！我做了很久的WB目前结果仍然是差强人意。
最初是DAB显色，条带太弱。换用ECL后，总是整张膜的荧光，看不到目的条带，但内参很亮，而洗膜后用DAB显色也可见到目的条带，只是很弱。
是不是我的问题也出在封闭的问题上了？
sunnyB (2013-11-17 16:52:12)
不用封闭 提高二抗稀释度（1:20000-30000） 如果不行就考虑一抗的问题
【求助】是二抗导致的背景高不？