【求助】双向电泳总蛋白，除盐一般用什么方法啊

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• wiwi (2013-11-17 21:27:02)

  除盐方法很多，透析，超速离心，超滤还有凝胶层析都可脱盐，透析脱盐的效果较好，但可能需要的时间较长；超滤脱盐较快速，脱盐的同时可达到浓缩蛋白的目的，millipore有好几种规格的超滤管，但脱盐可能不够彻底；凝胶层析脱盐可避免蛋白变性，也是一种较简易的脱盐方法。
  另外还可在聚焦的时候搭盐桥的。

• purrr (2013-11-17 21:28:35)

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  原帖由 wiwi 于 2013-11-17 21:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  除盐方法很多，透析，超速离心，超滤还有凝胶层析都可脱盐，透析脱盐的效果较好，但可能需要的时间较长；超滤脱盐较快速，脱盐的同时可达到浓缩蛋白的目的，millipore有好几种规格的超滤管，但脱盐可能不够彻底；凝胶层析脱盐可避免蛋白 ...

  这个 透析需要什么特殊的设备吗？？还是买点试剂就可以啊？

• mingming0638 (2013-11-17 21:28:55)

  肌肉组织中一般含酸比较多，不知道你进行蛋白提取后，加了溴芬兰，有没有觉得有点黄绿色，如果是这样的话，那一方面要注意除盐，另一方面还需要注意除酸，不过两种物质的去除方法应该是类似的，比如上面提到的沉淀、透析或者超滤等方法，我刚试过12%的TCA沉淀，可以将蛋白很好地沉淀下来，而又可以除盐和除酸以及其它杂质，另外还可以采用超滤，操作起来也比较方便，有离心机就可以了，不过要买专门的超滤离心管

• purrr (2013-11-17 21:31:01)

  QUOTE:

  原帖由 mingming0638 于 2013-11-17 21:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  肌肉组织中一般含酸比较多，不知道你进行蛋白提取后，加了溴芬兰，有没有觉得有点黄绿色，如果是这样的话，那一方面要注意除盐，另一方面还需要注意除酸，不过两种物质的去除方法应该是类似的，比如上面提到的沉淀、透析或者超滤等方 ...

  你好啊 ，因为我溶解的体积比较大，倒是没有发现有黄的迹象，不过聚焦时候，胶条的酸性端确实有点发黄，我现在的蛋白已经用裂解液稀释到可以到直接上样的浓度了，这样用TCA能沉淀下来吗？？令外请问下，裂解液和水化液是不是成分一样啊？？

• mingming0638 (2013-11-17 21:32:09)

  
  聚焦的时候，胶条酸性端发黄是很正常的，因为酸性端自然也显酸性，溴芬兰跑到酸性端的时候，做为酸碱指示剂，自然显示酸性条件下的黄色，TCA沉淀还是比较灵敏的，可以沉淀下来，裂解液和水化液的成分可以一样，也可以不一样，不过一般都差别不大，我自己用的是一样的，这样以免不同浓度的裂解液和水化液的配比不同造成最后的上样溶液不一致，以至于影响重复性，

• purrr (2013-11-17 21:32:37)

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  原帖由 mingming0638 于 2013-11-17 21:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  聚焦的时候，胶条酸性端发黄是很正常的，因为酸性端自然也显酸性，溴芬兰跑到酸性端的时候，做为酸碱指示剂，自然显示酸性条件下的黄色，TCA沉淀还是比较灵敏的，可以沉淀下来，裂解液和水化液的成分可以一样，也可以不一样，不过一般都 ...

  前辈说的很详细啊，谢谢啊，我有个问题请教啊 ，因为裂解时候，需要加DTT，蛋白酶抑制剂，两性电解质，这些东西常温很容易降解，我们是分装冷冻时候加，还是再配裂解液（或者说水化液时直接加），感觉如果直接加，中间可能还要一个较高温度放置一段时间不太合适，而最后加，又怕没有DTT，两性电解质，PMSF造成蛋白的重新溶解不好，或者说降解，因此，请问前辈是怎么样处理这个问题的？？

• mingming0638 (2013-11-17 21:33:15)

  
  一般是先不加DTT、IPGbuffer之类的，其它的东西配好，分装冷冻保存，需要用的时候，选择适量的溶液化冻，加入DTT和buffer之类的物质，溶解均匀，进行实验

• purrr (2013-11-17 21:34:39)

  QUOTE:

  原帖由 mingming0638 于 2013-11-17 21:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  一般是先不加DTT、IPGbuffer之类的，其它的东西配好，分装冷冻保存，需要用的时候，选择适量的溶液化冻，加入DTT和buffer之类的物质，溶解均匀，进行实验 ...

  很感谢你的耐心分析啊，我现在是这个问题，裂解的时候，溶液里只有尿素和chaps，而DTT,两性电解质，等助溶的东西都没加，这样离心后，我检测了一下蛋白溶度很低（1G原始样品，液氮研磨丙酮沉淀后，用6ML裂解液溶液，浓度仅为0.3微克/微升），直接PAGE胶也没有检测到），不知道是不是我没加DTT和两性电解质的原因？？请帮忙分析下啊，还是说我液氮研磨的力度和时间不够啊？？请指教啊

• Ao7 (2013-11-17 21:35:05)

  
  美国G-Bioscinces公司就有专门用2D样品的去盐和浓缩的方法。

• mingming0638 (2013-11-17 21:35:27)

  
  这么低的浓度？这种浓度说明基本上没有蛋白，动物蛋白一般很好提取的，不知道是否哪个步骤弄错了？

• coolcool (2013-11-17 21:35:53)

  
  就像mingming说的，你提的浓度这么低，很大的可能性是某个步骤出了问题，比如1，你的裂解液是不是过量了，我曾经50mg的组织最多加过1ml的裂解液，测出的浓度大概在4左右，后来减了裂解液的量，浓度自然也就上去了；2，你用液氮研磨完成之后，转移组织粉末尽量要完全，液氮研磨力度自己控制了，只要变成粉末就可以了，当然速度快点，很快就挥发尽了，可以再补加点，继续研磨，就差不多可以了。

• purrr (2013-11-17 21:36:19)

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  原帖由 coolcool 于 2013-11-17 21:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  就像mingming说的，你提的浓度这么低，很大的可能性是某个步骤出了问题，比如1，你的裂解液是不是过量了，我曾经50mg的组织最多加过1ml的裂解液，测出的浓度大概在4左右，后来减了裂解液的量，浓度自然也就上去了；2，你用液氮研磨完成 ...

  谢谢指点啊，你这个浓度的单位是微克/微升吧，能说下你最后溶解样品那个裂解液的成分吗？？

• coolcool (2013-11-17 21:37:20)

  
  对的，是ug/ul为单位的，我曾经用于提取肺组织的裂解缓冲液(7M尿素，2M硫尿, 4% CHAPS，2% IPGbuffer (PH3-10)，40mM Tris, 120mM DTT,)此外你可以适当的加些蛋白酶抑制剂比如sigma公司的cocktail,或者PMSF都行。

• tuomu45 (2013-11-17 21:37:41)

  
  丙酮沉淀

• purrr (2013-11-17 21:38:15)

  对的，是ug/ul为单位的，我曾经用于提取肺组织的裂解缓冲液(7M尿素，2M硫尿, 4% CHAPS，2% IPGbuffer (PH3-10)，40mM Tris, 120mM DTT,)此外你可以适当的加些蛋白酶抑制剂比如sigma公司的cocktail,或者PMSF都行。
  
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  谢谢前辈啊,说的很详细啊 ，只是DTT,IPGbuffer，很容易分解的，会不会在提取过程中失效啊 ？？因为提取需要数个小时呢
  

• coolcool (2013-11-17 21:39:19)

  
  你说的DTT,IPGbuffer虽然比较容易降解，都是用时临时配置加的，但是也没那么快就降解完失效了，这个就放心吧，只要保证你的整个提蛋白的过程尽量都是在冰上进行就没问题了，呵呵，刚开始做，注意的还是比较细致哈！

• purrr (2013-11-17 21:40:56)

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  原帖由 coolcool 于 2013-11-17 21:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你说的DTT,IPGbuffer虽然比较容易降解，都是用时临时配置加的，但是也没那么快就降解完失效了，这个就放心吧，只要保证你的整个提蛋白的过程尽量都是在冰上进行就没问题了，呵呵，刚开始做，注意的还是比较细致哈！ ...

  谢谢啊，我再提次看看效果啊