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【讨论帖】一种简单的亲和纯化方法

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-11-19 16:19    作者: jiushikeshui371    来源: 分析测试百科网

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【讨论帖】一种简单的亲和纯化方法

在普通的分离中一般都用层析柱分离，但是需要柱子和设备，这就限制了亲和介质的应用，这里介绍一种方法可以不需要层析设备就可以做分离纯化：
依据重组蛋白的表达量算出要用的金属螯合琼脂糖凝胶的量，金属螯合琼脂糖凝胶的载量为10mg/ml左右，样品先过滤，然后把一定量的介质直接投到样品中，在摇床上震荡5-12小时，保证要让介质悬浮起来，这样吸附更充分，而后抽滤，再用5倍介质体积的缓冲液含0.5M的NaCl在抽滤器上分三清洗，随后用3倍缓冲液含50mM咪唑分两次清洗，最后用3倍缓冲液含50mM咪唑分两次清洗，把收集的清洗部分跑电泳鉴定，这样不需要柱子也就可以分离带his标签的重组蛋白，快捷而且方便，没有柱子的情况下不妨一试，这个方法也适用于别的层析介质，只是洗脱方法不同而已。
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  • 6327555 (2013-11-19 16:19:29)


    是楼主自己用过的吗？看起来很不错。以前做过免疫亲和层析就是先用抗体与胶粒放一起摇一阵，摇后装柱。想来应该是一个道理。

  • jiushikeshui371 (2013-11-19 16:19:55)


    是呀，我最近很喜欢这样的方法，包括去内毒素我都是这么做的，我觉得非常好，而且对于某些作用力弱的蛋白，作用时间短还挂不上呢，这样晚上也可以做试验又不耽误时间而且可以同时做好几份呢，其实最好玩的是只要你测定上清和你原来样品的对比，你就知道有没有吸附，吸附了多少，一目了然，很好玩的，总比跑柱子快点。

  • 6327555 (2013-11-19 16:20:48)


    是的，但我觉得这种办法可能仅限于亲和柱吧，因为亲和反应发生得慢，用柱子流速慢就不合适，如果把这方法用来跑疏水柱和离子柱就不行了。楼主的看法呢？

  • 6327555 (2013-11-19 16:21:07)


    一样的，离子交换在工业上也有这么做的，疏水也没有问题，关键是样品要调好pH和电导，介质也这样就行，我现在也经常用阶段洗脱，这样洗脱后做电泳很容易摸最佳的条件，所以没有问题的，其实分子生物学的那些试剂盒就是用这样的方法，例如现在提取DNA质粒的试剂盒用的就是DEAE的功能基团，洗脱也是阶段的，前些日子做质粒制备的时候仔细读了试剂盒的说明书发现的。

  • 6327555 (2013-11-19 16:21:34)


    是这样啊，谢谢了。原来是因为实验室里制备量小，所以这些高招没有用过，呵呵。。。

  • jiushikeshui371 (2013-11-19 16:21:55)


    何必客气，我也是从做内毒素去除的时候老这么做所以才喜欢的，以前也没有这样做，其实这样做就是浓度有时候稀而且不一定很纯，如果条件把握好了，洗得很充分，那应该是不错的方法，对摸条件其实很有用处，特别是仪器不够用的时候。

  • 6327555 (2013-11-19 16:22:16)


    那Qiagen 用来去除内毒素的magprep 制备大量高纯质粒也是用你提到的提DNA用的介质了？

    内毒素也是蛋白，如何才能被从溶液中除去呢，是因为它们分子小吗？（我指从蛋白混合物中除去）

  • jiushikeshui371 (2013-11-19 16:22:44)



    我对试剂盒不很熟悉，但是通常的少量去除内毒素和DNA分离是可以通过离子交换树脂分离的，但是大规模是很难的，我们试过，所以最后我们是用专门去内毒素的亲和介质去内毒素的，而内毒素主要是磷脂多糖，很复杂，它们很容易形成聚合物，所以分子量范围分部很广，因此最好的去内毒素还是用亲和吸附好点，载量大，操作简单，而且收率高，Qiagen 的magprep有很多种，我不清楚，你可以发份材料看看就知道它用的是什么原理，我主要是做下游的所以对分子生物学和试剂盒不熟悉，但是介质合成和分离原理应该熟悉点，我只对pierce 去内毒素用的是亲和，而且Qiagen 用内毒素裂解液，估计是多粘菌素吧。

  • jiushikeshui371 (2013-11-19 16:24:00)

    Qiagen 用来去除内毒素的magprep 说可以做多大的质粒量，超螺旋比例到多少呢，很想了解一下

  • 6327555 (2013-11-19 16:24:56)


    没有测过呀？一般提完了就用酶切验证一下，没有测过超螺旋比。

  • jiushikeshui371 (2013-11-19 16:54:53)


    哦，我以为你知道呢，一般电泳完了，可以用光密扫描就可以知道超螺旋的比例了。

  • 6327555 (2013-11-19 16:56:03)

    Qiagen 用来去除内毒素的magprep 说可以做多大的质粒量，超螺旋比例到多少呢，很想了解一下

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    前几天刚好做了一下，跑的电泳，没有扫，但眼睛看起来超螺旋在80-90%吧，超螺旋后面有三条小带，是带nick 的和直链的。

  • jiushikeshui371 (2013-11-19 16:56:48)

    我们一般做了只有两条带，超螺旋后的带非常淡，纯度一般都大于90%，高的时候应该在95%吧。我比较喜欢用层析，试剂盒给我的感觉是暗箱操作，不很好自己把握。

  • greenbee (2013-11-19 17:00:22)

    你所说的抽滤是用什么样的装置啊，我的细胞破碎液先用0.22um滤器过滤可以吗，再把柱子与样品混合1个小时，时间足够吗？由于我们实验室条件有限，我用离心的方法老得不到蛋白，非常着急，希望得到您的答复！

  • fei1226com (2013-11-19 17:00:41)


    不知道这种方法的回收率如何

  • am10 (2013-11-19 17:01:40)

    需要纯化的蛋白约60KD，大肠杆菌表达，从包涵体洗涤、变性开始纯化，经过DEAE、CM等步骤，得到纯度约95％的产品，但内毒素常超标2－4个数量级。请问有没有较好的方法除去内毒素。

  • duoduo (2013-11-19 17:02:58)


    用多粘菌素琼脂糖除内毒素，AGTC和安马西亚都有卖，很好用的。

  • duoduo (2013-11-19 17:03:23)

    滤器就是哪种连真空泵的可以换膜的抽滤器，1000块一套吧，试剂器材公司应该有。细胞破碎液应该先离心去掉大的碎片，再在抽滤器中用0.22um的膜过滤，一小时足够了。

  • greenbee (2013-11-19 17:03:58)

    是不是过滤细胞用的那种啊,我们用的是正压,抽滤应该是用负压吧,你一般收集到多少样品再抽滤呢?

  • zwsyrt (2013-11-19 17:04:28)


    恩，我也用过类似的方法，非常方便，我是把样品跟胶混合，在摇床上充分震荡，以利于吸附。我想，这样的方法应该适用于任何跟吸附有关的制备层析，无论是金属螯合，亲和层析，又或者是其他的……
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