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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-11-20 16:38 作者: misswu61 来源: 分析测试百科网
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最新回复
rxcc33 (2013-11-20 16:38:32)
下次麻烦给电泳图作一说明,另外你的上清是指穿透峰吗?下面这个帖子可供你参考
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/550772')
misswu61 (2013-11-20 16:38:57)
不好意思,先作一说明:右起1、2、3、4条带分别为:蛋白Marker、破碎前上清、破碎后上清、过Ni柱后的上清;目的蛋白分子量14KDa,在图上最下位置的条带为目的蛋白条带,纯化还处于初步阶段,我是用离心方法得到的上清。另外,我作了WESTERN BLOT,已经证明表达了的目的蛋白。
hold住 (2013-11-20 16:39:20)
减少上样量,降低流速,增加介质与目的蛋白的接触时间,如果效果不好,可以适当的加一些非离子的表面活性剂如Triton x-100
2541 (2013-11-20 16:39:45)
如果洗脱中有目的蛋白,而上样穿透中也有,那么说明上样量太大,如果洗脱中没有,应该是没有结合上去,Q1:为什么没有洗脱的电泳条带?Q2:冒昧,目的蛋白是否是可以结合Ni柱的?
misswu61 (2013-11-20 16:40:04)
从电泳结果看上样穿透前后没有明显变化,表明上样穿透液中有目的蛋白;在洗脱液中没有见到目的条带,分析蛋白没有结合上去。但我之前做了抗His Western blot,结果表明目的蛋白带有His标签。我再减少上样量、加Triton x-100 试一试,谢谢各位!!
vera+ (2013-11-20 16:41:01)
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/550772')
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请问 fruitsu 穿透峰 指什么东西?
谢谢
3648755 (2013-11-20 16:41:21)
在平衡缓冲液和样品中都不要加咪唑,降低流速0.5-1ml/min,这样再挂柱看看,或者可以参照我们以前的说法,直接把介质加到样品中,震荡2-3小时,直接用介质加loading buffer,煮5-10min跑电泳看有没有带,然后再在柱上分离。
misswu61 (2013-11-20 16:41:43)
我减少了上样量、加了Triton x-100 ,重新进行了一次纯化,但结果仍不好.我怀疑是Ni-NTA Agrose的问题,想问问高手,Ni-NTA Agrose有沉淀,加填料之前,需要把Ni-NTA Agrose混匀吗?
rxcc33 (2013-11-20 16:42:05)
当然需要均匀了,要不然会影响柱效的,轻轻搅碎,你可以加20%乙醇过夜
misswu61 (2013-11-20 16:42:29)
Ni-NTA Agrose上层是乙醇,加入的调料中有乙醇对实验有影响吗?做了两次仍得不到结果,哪位高手能否提供一些纯化方面的资料或你们纯化的实验步骤,非常感谢!!
rxcc33 (2013-11-20 16:42:54)
我给你发了份详细的金属螯合层析的材料,你看看吧,会有帮助的,当然乙醇会有影响了,使用前先用水后用缓冲液平衡柱子,否则样品遇到乙醇如果有沉淀那就什么也做不出了,此外有机溶剂也许会对吸附不利,无论什么原因都需要平衡好柱子再上样。
鹿奔奔 (2013-11-20 16:43:25)
请问版主,镍柱遇到乙醇了还能再使用么?
【求助】Ni柱结合不上目的蛋白如何处理