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【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀
目前我在表达一个26k左右的蛋白，pET32a载体，可溶性表达，带有Trx标签，500mM咪唑，20mM磷酸盐，PH 7.4洗脱，因为要做EK酶切，打算把体系置换为磷酸盐缓冲体系，然后过SP去除标签，可透析后出现大量沉淀，纯化下来的蛋白质浓度大概在2mg左右，但为了保证EK酶切的效率，就没有稀释。请问这种情况该如何处理？EK酶切在有咪唑存在的情况下是否可行？另外EK酶切的温度一般在多少为好?我用的推荐使用22度16小时，但对我的蛋白效果一般，请问37度对蛋白影响怎么样？【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀
有点长，谢谢耐心看完，寻求帮助！
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nn255 (2013-11-21 15:51:43)
1、酶切条件：20mM Tris pH8.0,35-37度，16小时，做酶切梯度，找出最佳酶量。
2、咪唑对EK活性有影响，应该去除。透析沉淀情况不明，可能和pH有关，可以考虑提高pH。
3、酶切是融合蛋白不用做稀释，我用20-30mg/ml的浓度也一样切。
4、市场上的EK有两种，一种是E.Coli.表达，活性低；一种是酵母表达，活性高。
5、37度对蛋白有没有影响是无法事先判读的，做一次看看不就可以了吗。
6、除酶切后的标签蛋白，可以考虑再用一次Ni柱。
花想容 (2013-11-21 15:55:54)
解答太详细了，多谢！透析我尝试了几个PH值，9.0,8.0,7.4，都不行，蛋白理论等电点是8.8,应该用多大PH。
另外盐浓度对EK酶切有影响没？谢谢！
nn255 (2013-11-21 15:56:53)
可溶上清表达，Ni柱纯化后透析去除咪唑产生大量沉淀，这在我的经验中从来没有遇到过。能否把整个试验流程的缓冲体系讲一讲，看看怎么回事。
盐浓度都酶切有影响，高浓度盐抑制EK活性。
花想容 (2013-11-21 15:57:19)
载体，pET32a，1mM IPTG诱导，超声破菌后离心保留上清（电泳验证目的蛋白在此）。上样buffer：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，平衡镍柱，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，20mM 咪唑洗脱杂蛋白，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑洗脱目的蛋白，也尝试过不加NaCl的。
透析液：1、50mM tris， PH 8.0,9.0,7.4
2、20mM NaH2PO4 PH 8.0,9.0,7.4
都出现沉淀。蛋白等电点大概在8.8左右，还有要提的一点是，洗脱蛋白-20度冷冻保存复溶后也产生沉淀。洗脱蛋白浓度大概在2-3mg/ml，尝试过稀释到1mg/ml左右，也有沉淀。
请帮我分析一下。另外我看园子里有用“万金油”进行蛋白透析复性的，不知道用在我这上面是否可以啊？
花想容 (2013-11-21 15:57:58)
QUOTE:
刚刚再次拜读了您之前发的帖子，发现我目前这个蛋白和你所纯化的蛋白A比较类似，我是否可以用类似的方法呢？另外就是我不知道我这个蛋白的可溶性怎么样，如果镍柱纯化下来以后脱盐置换缓冲体系，是否会沉淀在柱子上呢？nn255 (2013-11-21 16:00:30)
1、超声破菌buffer同上样buffer？pH？
2、20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑 这个溶液检测过pH没有？
如果回答都是yes的话，我也不知道沉淀的原因。
万金油中含有EDTA，对EK有抑制。
如果透析有沉淀，那么G25换液也很有可能沉淀。
[ 本帖最后由 nn255 于 2013-11-21 16:02 编辑 ]
花想容 (2013-11-21 16:03:08)
dragonkilly (2013-11-21 16:03:28)
蛋白在等电点的溶解度是最低的，你的是8.8，不适合用9和8吧，大概再低一些，另外你的蛋白本身是可溶还是膜蛋白，离子强度由500mM突然降到0，会对结构有很大影响的
hold住 (2013-11-21 16:05:47)
你纯化的buffer中都有0.5M NaCl，但透析溶液里就只有20mM NaH2PO4？可能是离子强度不够蛋白沉淀了。试一下透析buffer中加入0.1％Triton X-100或者甘油，并且提高NaCl浓度。或者你可以在Ni柱上切啊，这样连咪唑洗脱都不用了。
am10 (2013-11-21 16:06:15)
我觉得可以这样：利用2M尿素有促溶的效果，先透析到2M的尿素中，再缓慢透掉咪唑，最后再透掉尿素！
fei1226com (2013-11-21 16:08:18)
蛋白质透析除咪唑大量沉淀是比较常见的现象。
可能的原因：
1：咪唑本身具有很强的缓冲能力，尤其是高浓度的咪唑，所以很容易使透析buffer的pH值发生改变，从而使蛋白沉淀。
2：咪唑对有些蛋白的可溶性具有一定的帮助，将咪唑更换成其他的buffer体系时蛋白会发生沉淀。
3：透析的过程还是比较快的，buffer体系变化过快也会导致某些不稳定的蛋白沉淀。
解决办法：
1：柱上酶切，可以把透析咪唑这一步直接省略掉。
2：过离子柱之前不透析，直接稀释上样。
祝你好运！
花想容 (2013-11-21 16:09:27)
多谢楼上各位的解答，我又继续尝试了几个条件，目前看来，盐浓度是产生沉淀的主要原因。0.5M NaCL的情况下沉淀很少。这就出现了一个问题，我不知道这个浓度的NaCl对酶切有什么影响,正在尝试。
另外楼上几位所提的柱上酶切是这么做的，有大概方案么？
qqq111 (2013-11-21 16:09:59)
QUOTE:
可以先将样品挂上Ni柱，并用酶切buffer平衡好，再把EK用1个柱床体积的酶切buffer稀释好，流进柱子里面，保温反应，反应完之后用酶切buffer洗下切下来的蛋白，最后用含咪唑的buffer洗下挂在柱上的蛋白，跑胶分析酶切的效率花想容 (2013-11-21 16:12:38)
有一个问题，我这个蛋白切下来以后就没有标签了，那么我的蛋白应该在直接用酶切buffer洗下来的液体里吧
qqq111 (2013-11-21 16:19:16)
QUOTE:
当然花想容 (2013-11-21 16:19:44)
另外今天无意中想到胰岛素溶解需要用HCL来溶解，是否我的蛋白也类似于胰岛素呢？大家是否有类似的经验，因为HCL酸性太强，我应该用多大的浓度来调呢，一半蛋白质可以耐受多大的酸度，或者说PH值？
finger (2013-11-21 16:20:06)
你应该是想置换成TRIS-HCL缓冲体系吧！这样是会产生沉淀，建议你开始就用TRIS-HCL可以省去很多麻烦！
花想容 (2013-11-21 16:20:31)
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我想置换为PBS或者tris体系都可以，也都试过了，都不行。
newway (2013-11-21 16:23:39)
可以考虑加入glycerol或sucrose
如果蛋白有一定的疏水性可以考虑加入少量detergent
huifeng0516 (2013-11-21 16:23:55)
【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀