【求助】表达的目的蛋白比实际要大几个KD

最新回复

• bamboo16 (2013-11-23 17:20:27)

  但表达出的目的条带有24KD大小，
  
  是电泳测出的结果吗？电泳测的分子量不准。

• avi317 (2013-11-23 17:20:48)

  
  电泳上的分子量不精确,有些误差很正常.

• 尘朵朵 (2013-11-23 17:21:14)

  
  我跑电泳时同时跑了MARKER，我是根据MARKER大小确定的分子量，有问题吗？

• avi317 (2013-11-23 17:21:35)

  当然是有误差的,所以没有关系,因为电泳误差也不差不多有几个KD,因此我觉得不用担心,应该是你的目标蛋白.

• loli (2013-11-23 17:21:59)

  误差是有可能的，
  再就是你估计的蛋白分子量可靠吗？
  还有你用的marker是预染的还是你加marker时候染的。
  都会影响你的结果的。
  可以过一个分子筛看看。

• wmp1234 (2013-11-23 17:22:27)

  
  这种现象很正常，实际上应该从SDS-page的原理来看：就是蛋白经过处理后被认为形成棒状，表面均匀吸附离子（SDS），不同大小的蛋白形成相不同大小的“棒状”体，跑胶时通过分子筛和电荷效应被分离。
  实际上，不同的蛋白由于不同的氨基酸成份等原因，并不符合这一基本假设（实际上每个蛋白都或多或少的偏离这个假设），因此出现偏移是正常的。
  我们讲蛋白大小时应当加上条件，比如说：A蛋白理论大小为20KD，SDS-page显示为24KD。

• wmp1234 (2013-11-23 17:22:51)

  我用PET28B表达氨基端带HIS标签的目的蛋白，预测分子量大小为20KD，但表达出的目的条带有24KD大小，序列测序正确，阅读框架正确，终止密码为TAA。重挑一个克隆进行表达也出现同样的情况，只是现在还没进行WESTERNBLOT验证。不知各位遇到过类似情况没有？
  
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  我现在做的一个蛋白就是由序列预测为64KD, SDS-pase显示为75－80KD。

• 尘朵朵 (2013-11-23 17:23:20)

  我就是还想明白导致误差的原因，免得老板问起不知该如何解释这种现象。

• avi317 (2013-11-23 17:23:45)

  QUOTE:

  原帖由 尘朵朵 于 2013-11-23 17:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我就是还想明白导致误差的原因，免得老板问起不知该如何解释这种现象。

  应当从分子筛和电荷效应来考虑吧：）
  分子筛效应我觉得影响不会太大，因为蛋白在SDS中已经变性，形成“棒”状，不过具体情况以及是否有特例我说不好。
  我的理解就是：可能是蛋白中不同氨基酸的含量造成的，我前几天看一篇文献里面讲他做得那个蛋白在SDS-page中发生较大的偏移是因为两种氨基酸含量较高造成的（具体哪两种氨基酸我忘了，不过我觉得可能是一些酸碱性或者是带较强电荷的氨基酸）。

• wood533 (2013-11-23 17:24:32)

  我就是还想明白导致误差的原因，免得老板问起不知该如何解释这种现象。
  
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  1、His-Tag是造成偏差的原因之一。推测由于His-Tag中的碱性氨基酸(组氨酸)的作用造成蛋白在SDS-PAGE中迁移变慢,而导致偏差,碱性氨基酸,带有正电荷,而His-Tag中含有连续6个组氨酸,带有较强的正电荷,改变了蛋白在SDS-PAGE中的泳动行为,降低了蛋白的泳动速率,导致了表观分子量的变大。His-Tag研究的基因进行表达及其产物纯化时,都有可能遇到SDS-PAGE不能准确反映其分子量的问题;如果忽略了可能存在的偏差,会导致对结果的错误判断。
  2、进行N或Ｃ末端氨基酸顺序测定、电喷雾质谱分析,可以证实其实际分子量与理论值一致。
  

• wmp1234 (2013-11-23 17:25:03)

  
  还有实验本身的误差,因为毕竟电泳是定性非定量手段,怎么能和预测一点误差都没有呢,我觉得要是一样那才怪了呢.毕竟是估算的,不会完全一致的.