【求助】请问蛋白交联的方法和技术？

最新回复

• wanglaoshi (2013-11-23 22:29:54)

  
  蛋白质交联做得怎样？我这里有本专门讲蛋白质交联的专著。

• zhihui小新 (2013-11-23 22:30:18)

  
  活细胞用1％甲醛处理10分钟就行了，很简单，效果比紫外好。

• guagua (2013-11-23 22:30:45)

  
  我这里有关于蛋白质交联的方法
  
  1、载体蛋白的选择
  载体蛋白除了具有较好的免疫原性外，还应该具有足够的反应侧链氨基酸残基，以便与合成肽连接。常用的蛋白载体及其相关特性见表1。
  表1 与多肽连接的常用蛋白载体
  
  残基树/分子
  载体 M（KDa）
  ε-NH2 -SH 酚 咪唑
  BSA 67 59 1 19 17
  OVA 43 20 4 10 7
  肌红蛋白 17 19 0 3 12
  破伤风类毒素 150 106 10 81 14
  KLH 2000 6.9 1.7 7.0 8.7
  
  2 连接方法的选择
  大多数连接方法依赖于游离的氨基(Lys)、巯基（Cys）、酚基（Tyr）羧基（Asp或Glu）的存在。选择连接的方法是多肽与载体通过C-或N-末端残基连接。相应于蛋白质氨基端的多肽则通过其氨基末端氨基酸的残基连接。如果合成的多肽具有游离的巯基，而蛋白载体具有游离的氨基，则可以用MBS直接连接，但是在合成多肽时其C-或N-末端必须加入Cys残基。来源于N-端序列的多肽与载体蛋白连接可将一个Cys加入到多肽的C-末端。来源于C-端序列的多肽，以同样的方式将Cys加入到多肽的N-端。如果被选择的多肽存在内部Cys残基，也可以用MBS连接。
  如果由于某些原因不能通过MBS连接，则可应用重氮化对氨基联苯胺法（bis-diazotized benzidine,BDB）通过C-或N-端Try连接，碳二亚胺法（1-ethyl-3-(3-dimethylaminoropyl0-carbodiimide,EDCI)以C-或N-端连接，或戊二醛（glutaraldeldehyde）通过N-端α-氨基连接。蛋白载体与多肽连接的常用试剂及其功能基团见表2。
  
  表2 半抗原或多肽与载体蛋白连接的常用偶联剂
  
  修饰的氨基酸
  偶联剂
  初次反应 二次反应
  MBS Gys-SH
  戊二醛 ε-NH2Lys，α-NH2，SH-Cys Tyr，His
  BDB ε-NH2Lys，α-NH2，
  EDCI ε-NH2Lys，α-NH2，α-COOH，Glu，Asp Tyr，Cys
  Bis-imido酯 ε-NH2Lys，α-NH2，
  
  3  连接方法概述
  MBS连接法：MBS是目前已知的最好的异双功能的交联剂，在中性PH环境，将巯基组与氨基交联。第一步反应是通过载体蛋白与MBS连接，形成MBS/KLH连接物。层析纯化后，MBS/KLH与含Cys的合成肽交联。反应过程中，有合成肽Cys残基提供巯基组，载体蛋白N-端和Lys侧链提供氨基组，合成的多肽必须具有游离的-SH，二硫键不宜用此法连接。
  戊二醛偶联法：戊二醛也是双功能偶联剂，它的两个醛基可分别与合成肽或半抗原与载体蛋白连接在一起，最好在多肽的适当部位含有Lys残基。首先将KLH与多肽混合，然后应用戊二醛法交联，以甘油封闭为反应的戊二醛。
  EDCI法：EDCI是一种化学性质很活泼的双功能试剂，其偶联反应既可以发生在氨基部位，也可以发生在羧基部位，将多肽C-端羧基与载体蛋白游离的氨基即Lys侧链连接，因此含有内部Asp，Glu或Lys残基的多肽不宜用此法。第一步是多肽与EDCI连接，然后加入载体蛋白，经过透析即可获得偶联物。
  BDB连接法：BDB是将Tyr侧链与载体蛋白Tyr侧链连接，但通过与His、Cys和Lys侧链相互作用也可连接。如果没有这些残基，在合成多肽时，可在多肽的C-端或N-端加入一个Tyr残基作为连接点。

• 二子 (2013-11-23 22:31:12)

  
  老兄，您能给我发一份关于蛋白交联的文献吗？多谢！
  
  另外，我想问一下是否有相关的试剂盒。