【求助】果蛋白降解，我该怎么办？

最新回复

• biabiade (2013-11-24 00:04:19)

  
  如果确信蛋白提取出来以后降解了，那替你惋惜，只能重新去提取
  这时候你就要分析是什么原因造成了它的降解，是不是环境中存在的蛋白酶呢？
  如果是的话，那下次再提取的时候就要在提取液中加入蛋白酶抑制剂，有几种，好像还有什么PMSF
  试试看

• ii077345 (2013-11-24 00:04:37)

  
  我的蛋白电泳昨天还是好好的，电泳结束以后有很漂亮的条带，一夜之间就全变了，在胶上只能见到涌到，其他什么带都都没有，包扩我新处理的蛋白，也不知道是为甚么，而且我提取时加入pmsf了，od直也测出来了呀，能帮帮我吗？不胜感激。

• yychen (2013-11-24 00:06:34)

  
  我也遇到过这种事,不过没有这么严重,我的出现了很多杂带.
  
  我是由于两次跑的胶浓度不同产生了不同的分离情况.
  
  你的情况可能是降解了,这样OD值不会策不出来,但是却没有条带.
  
  另外,你的蛋白如何保存?冻熔后有无沉淀产生?
  
  再跑一次看看吧,然后再确定原因.

• ii077345 (2013-11-24 00:09:02)

  
  我实验中也有遇到过这样的情况，当时我们重新配了上样buffer和丙稀酰胺后就好了。此外，样品保存也很重要，我通常是提取的蛋白质分装后一部分直接-70保存，一部分加buffer煮沸后-70保存，总不会两种条件下的东西都降解吧。

• newway (2013-11-24 00:09:21)

  蛋白降解了还有用吗？只能重新提取了

• zhezhe (2013-11-24 00:10:19)

  首先确定你提取的蛋白质是否降解了。如果是的话，我只能对你表示同情！
  
  我说说我们提取蛋白质的一些情况，希望对你下一次再提取时有点帮助：
  1.在提取蛋白质过程中最好连续，整个过程最好在4度下进行；在接触蛋白质的缓冲液或其他试剂中都加一点蛋白酶抑制剂（如PMSF等）防止蛋白质的降解，有时在透析液或其他溶液中也要加入抑菌试如叠氮钠）。
  2.提取的蛋白质原液最好浓缩一下（我们用浓缩膜浓缩的），蛋白质在稀溶液中更容易降解。
  3.在做完电泳、westblot、测定蛋白质的浓度后就及时分装保存。
  4.直接的纯化的蛋白质溶液保存也相对容易降解，你可以采取蛋白质干粉可以-20度保存。
  5.液态保存蛋白质时加甘油保护-20度也可以保存，如果你短时间不用，建议-70度保存备用。
  最后祝你好运！

• ii077345 (2013-11-24 00:10:45)

  
  因为我的蛋白样品天天用所以放在4度冰箱里，有一部分冻在－20但是动容后也没有沉淀产生，今天我重提了蛋白跑完的结果还是一样的没有带的。重新配制电泳缓冲液和丙稀酰胺后有点带了，但是也不像原来那么漂亮清楚了。上样buffer一直保存在4度，每次都用他调浓度，他对蛋白的影响会很大吗？

• sunshine039 (2013-11-24 00:11:28)

  
  蛋白样品天天用，应该分装成小包装，在－20度保存，况且避免蛋白质的反复冻溶是保存的一个常识，不仅使其容易降解，也难以保证其蛋白质的生物活性。
  各种试剂最好不要放置太长时间，因为起PH值等都会有所变化，影响电泳效果。
  上样buffer当然可以在4度保存，我不明白你：“上样buffer一直保存在4度，每次都用他调浓度”是什么意思，上样buffer能调蛋白质浓度？（我们的聚丙稀酰胺凝胶电泳的上样2×buffer是这样的：1 mmol/M Tris-HCL ph6.8 2.5ML,β-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6克，甘油2.0ml，0.1%溴酚蓝1.0ml，双蒸水3.5ml)。
  
  最后祝你好运！

• kewanqi2011 (2013-11-24 00:12:02)

  
  我保存蛋白一般都是先分装成20μl/EP管，保存在-70℃，用的时候就拿一管，这样蛋白就不容易降解了！希望对你能有所帮助：GOOD LUCK！

• ii077345 (2013-11-24 00:12:31)

  如果我的蛋白一直保存在四度会有影想吗，我的上样buffer跟您的配方一样，用他调浓度就是说案1：5的关系加入蛋白中煮沸，然后上样，我是想问上样buffer时间长了会影响电泳吗？也许是因为我太急了，所以没有表达清楚。

• sunshine039 (2013-11-24 00:14:57)

  
  蛋白一直保存在四度肯定会有影响,容易降解,除非是蛋白质干粉可以这么放,不能反复冻溶..没有-70度的条件你把它分装后放置-20度冰箱不是很方便吗?就如楼上战友的方法,可以分装成小包装低温保存.用时拿一点出来就行了啊!我们电泳时,加等量的2×上样buffer,1:5恐怕不太合适,这个比例加上样buffer我们没做过.

• ii077345 (2013-11-24 00:15:19)

  
  我的问题解决了，重新配了上样buffer和丙稀酰胺，跑的带好多了，谢谢大家热情相助！！！

• 二丫头466 (2013-11-24 00:15:40)

  降解多了，还是重新提蛋白吧