【求助】我的β-actin出好多杂带~~怎么办

最新回复

• guagua (2013-11-24 11:57:12)

  
  55kd的带是重链，小鼠的组织样品里面含有很多的IgG，就会和鼠的二抗反应，最好用兔抗的actin来检测，或者从50kd左右剪开膜，只压下面的43kd的actin。

• bling (2013-11-24 11:58:47)

  
  我们实验室一般做的是43KD的actin。

• dreaming (2013-11-24 11:59:54)

  
  2抗浓度再稀释低点吧，或者吐温多加点

• hustwb (2013-11-24 12:00:18)

  
  一抗的稀释比例太高了，内参一抗1:3000以上

• hustwb (2013-11-24 12:01:29)

  
  还有一种可能就是一抗的问题：不是很特异。CST家就很好，Abart家的也不错

• yueban-1147 (2013-11-24 12:02:05)

  本人现在在做小鼠的肝组织的western blot，但在做内参β-actin出好多杂带，从来都没碰到这种情况，而且每次显影在55KD附近出现一条很亮的带~~怎么会出现这多的杂带啊~~盼高手能帮我解答，，不胜感激，，
  
  我用的β-actin抗体的santa的，二抗是KPL的山羊抗小鼠HRP,封闭用的是5%脱脂奶粉（TBST含0.1%吐温-20）在37°C封闭1h，一抗稀释是用封闭的牛奶，一抗稀释比为1:1000，一抗孵育条件是4°C过夜，洗脱一抗是用的TBST（含0.1%吐温-20）4*5min，二抗稀释比是1:4000，洗脱二抗用TBST5*5min
  
  盼高手能帮我解答，，不胜感激，，！~！！！！急急急~~！！！！
  
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  我觉得你换个奶粉，或者在奶粉里加上点BSA封闭1.5-2h试试！

• vcve (2013-11-24 12:03:14)

  
  ~~怎么会出现这多的杂带啊~~
  
  可以考虑
  封闭4°C过夜，封闭液用5%BSA（TBST含0.05%吐温-20），一抗稀释用0.5%BSA（TBST含0.05%吐温-20），一抗一抗孵育条件室温2h，洗脱一抗用的TBST（含0.05%吐温-20）20min摇床上洗两次，再用TBS（不含吐温-20）摇床上洗一次，洗脱二抗同样条件。这样做可以很好的解决杂带和高背景等问题。
  
  注：TBST及TBS一定要足量，膜放在大平皿中洗涤，TBST及TBS配方：
  
  TBS每2000mL(pH7.4)：NaCl 16g
  
  KCl 0.4g
  
  Na2HPO4.12H2O 7.25g
  NaH2PO4.2H2O 0.48g
  TBST在TBS基础上加0.05%的Tween20。

• bluelake (2013-11-24 12:04:43)

  
  我做的是人的组织，actin是兔抗人的，santa，其它条件和你几乎一样，二抗1:3000,KPL，也是在55KD处条带特别明显，43KD条带比较细。

• xiaoxiaoniao (2013-11-24 12:05:28)

  
  用小鼠做的抗体确实是IgG含量会高，55KDa的条带很可能是重链的条带，用兔抗鼠的二抗试一试，可能会好些，我也出现过相同的现象。