【求助】western 加ECL后膜周围出现荧光

最新回复

• biabiade (2013-11-24 21:19:40)

  内参一般都属于在细胞内比较高表达的，所以很容易检测到，目的蛋白的表达丰度肯定不如actin，内参出来了说明你们的western体系可以正常工作，但针对不同的目的蛋白，抗体的孵育条件（稀释比例及孵育时间），蛋白上样量，以及转膜时间都可能是不同的（当然对于47k的蛋白而言，转膜条件和内参一样就好了）
  
  膜的边缘发亮，不是很清楚导致这个现象的具体的原因是，但是肯定是说明有非特异性结合的二抗结合上去了，你的膜裁剪的时候用的剪刀干净吗？还有两张膜分别做内参和目的蛋白的时候，是转膜后就分开独立做的吗？洗膜尽量还是在两个盒子里分开进行。

• jingling845 (2013-11-24 21:20:02)

  
  剪刀和做内参的用的是一样的，同时剪的，转膜后是分开做的。

• jingling845 (2013-11-24 21:20:25)

  
  下面是图片，上面的是内参，下面的是目的蛋白。

  
  34977946.jpg

• greenbee (2013-11-24 21:22:19)

  如果荧光强度特别大，例如，在显影前，肉眼都可以看见荧光了，往往显影的时候周围是黑的，而条带处是白的，可能是因为曝光过度引起的。但是往往发生这种情况后，可以看见白色的条带。
  
  我感觉你的膜背景非常高，周围的黑颜色，都是从切下来的膜的边缘露出来的光，之后曝光了底片导致的。如果是这样的话，你需要解决两个问题，第一，强背景的问题，且是非异性的背景；二，需要降低放光强度。第二个问题好解决，少用ECL就可以，可大比例稀释后再用。第一个问题就很难回答了。
  
  第一次见你这样的情况，希望有帮助

• vcve (2013-11-24 21:22:42)

  谢谢，问了好多人都不知道是怎么回事。

• ffaa (2013-11-24 21:24:19)

  
  ECL加的太多啦

• ffaa (2013-11-24 21:24:36)

  如果荧光强度特别大，例如，在显影前，肉眼都可以看见荧光了，往往显影的时候周围是黑的，而条带处是白的，可能是因为曝光过度引起的。但是往往发生这种情况后，可以看见白色的条带。
  
  我感觉你的膜背景非常高，周围的黑颜色，都是从切下来的膜的边缘露出来的光，之后曝光了底片导致的。如果是这样的话，你需要解决两个问题，第一，强背景的问题，且是非异性的背景；二，需要降低放光强度。第二个问题好解决，少用ECL就可以，可大比例稀释后再用。第一个问题就很难回答了。
  
  第一次见你这样的情况，希望有帮助
  
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  大侠你好！我做WB也是整篇可见荧光，很长时间都不淬灭，压片出来也就是个膜的形状。
  
  但是后来洗掉ECL之后，重新做DAB显色便有条带，请问是不是ECL需要大比例稀释啊？
  
  而通常大比例稀释是指怎么个稀释法？几倍稀释呢？

• 101010 (2013-11-24 21:24:57)

  你可以试一下用PBS稀释，我们以前用1：1000稀释，效果还是很好。另外，ECL上膜的时候，ECL的用量尽量少，例如200微升，但是要涂布均匀。你可以先做一个小样试试这样方法可行不