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【求助】WB10KD 做的快吐血了
我是个新手才学2个月,就接到个让我吐血的10KD 先是用的SDS-PAGE 做了无数次 居然出来了一次,但只是昙花一现,再也没出来过了。后面全是连着的一根像是弥散了一样。我甚至在怀疑我那次是不是我要的目的带。【求助】WB10KD 做的快吐血了
现在用tricine-SDS-PAGE也不见效果 ,连内参都跑的丑陋的很,目的带看不见。各位大侠,请指点一二啊!要是有明确的一套就再好不过了。再次先谢过了。
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最新回复
bangqi_k (2013-11-24 22:26:32)
tricine-SDS-PAGE要延长转膜时间,你可能是电泳没跑好,电泳试剂重新配呗
www.1 (2013-11-24 22:26:50)
延长?我的是100v 30min 还要多久啊!东西是新配滴!
uuooii (2013-11-24 22:27:08)
www.1 (2013-11-24 22:27:50)
呃……我是先做的SDS-PAGE,是做出来滴!只是目的带是连着,后来查了很多都说小分子应该用tricine-SDS-PAGE,现在改用tricine-SDS-PAGE但是背景很深能模糊的看见带,貌似还是连着滴!我这样说不知道我说明白没的。
阿司匹林 (2013-11-24 22:28:09)
怎么搞的啊tricine-SDS-PAGE 2KD的都能跑出来的
阿司匹林 (2013-11-24 22:28:54)
怎么搞的啊tricine-SDS-PAGE 2KD的都能跑出来的
66258932.jpg
chuntian1983 (2013-11-24 22:29:31)
兄弟,你用的是百分之十几的胶? 你应该把你的胶配方带上,大家也好帮你分析啊。
另外你的转膜时间确实短了,100V的话至少得1小时
www.1 (2013-11-24 22:29:53)
1块胶
WG
1.88ml
30% Gel.sol
2.8ml
3M TrisHCl pH 8.45
2 ml
10% SDS
0.06 ml
10%APS
0.06 ml
TEMED
0.003 ml
Total
6.003 ml
间隙胶配方: 10%
Spacer Gel (10%)
1块胶
dH2O
0.47 ml
30% Gel.sol
0.5 ml
3M TrisHCl pH 8.45
0.5 ml
10% SDS
0.015 ml
10%APS
0.015 ml
TEMED
0.0015 ml
Total
1.5015 ml
浓缩胶配方:4%
Stacking Gel (4%)
1块胶
2×Stacking. buffer
1.5ml
30% Gel.sol
0.75ml
ddH2O
0.75ml
TEMED
4ul
10%APS
40ul
Total
3.44mL
这是配方不知道大伙能看明白不
chuntian1983 (2013-11-24 22:30:10)
凝胶配方我没看出有什么问题,不知道其他兄弟能看出来不。 其实你要10KD的话,用SDS-PAGE 15%的胶,100KD的蛋白Marker,应该就能跑出来的,这样操作会比较简单,等跑出条带再做后面的步骤吧,要不浪费时间跟精力啊
www.1 (2013-11-24 22:30:37)
www.1 (2013-11-24 22:31:31)
feima+ (2013-11-24 22:31:47)
减少上样量试试吧
okhaha (2013-11-24 22:32:15)
我觉得吧,你至少也要15%的胶跑 转一般45min到1h就可以了。在就是用。22的膜,加大上样量。
hulu呼噜 (2013-11-24 22:32:42)
15%的胶来跑 一定得等marker 出了5 之后才能停电泳 你是用的湿转? 我觉得小分子量的半干转好些 15v 30min就OK了
ns5fan (2013-11-24 22:33:24)
减少上样量试试~~
veiwu (2013-11-24 22:33:48)
条带连着我也觉得上样量太大了。如果非要这么大上样量才能杂交出来,那也只能这么做了吧
www.1 (2013-11-24 22:34:06)
eBioscience这个公司的抗体怎么样啊!最近10KD的一直出不来,抗体刚买回来的时候能做出来。可过了两个月就再也做不出来了。抗体是在4°保存的,以前1:500能做出,现在1:250都是空白的。
www.1 (2013-11-24 22:34:48)
eBioscience这个公司的抗体怎么样啊!最近10KD的一直出不来,抗体刚买回来的时候能做出来。可过了两个月就再也做不出来了。抗体是在4°保存的,以前1:500能做出,现在1:250都是空白的。
911 (2013-11-24 22:35:13)
koook5695 (2013-11-24 22:35:33)
抗体为什么要放4℃保存?应该放-20℃吧。
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