【求助】带组氨酸标签的大肠可溶表达蛋白的纯化

最新回复

• abc816 (2013-11-26 16:32:55)

  QUOTE:

  原帖由 windy+++ 于 2013-11-26 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  各位纯化高手，我们部门目前做出来一种带组氨酸标签的蛋白，在大肠中表达出来的，是可溶的，但是杂蛋白很多，Ni-柱纯化后，杂蛋白基本上没有怎么除去，请教一下，给出个方案！ ...

  换柱子

• DNA (2013-11-26 16:33:15)

  菌体裂解的buffer？含有咪唑会好一点？甘油的有？盐浓度？

• yes4 (2013-11-26 16:33:41)

  
  HIS标签蛋白洗脱后杂带较多,什么原因?如何优化?
  1,可能原因:蛋白酶部分降解了标签蛋白,
  策略:请添加蛋白酶抑制剂,(慎用EDTA)。
  2,可能原因:杂质对镍离子有更高的亲和性,
  策略:咪唑浓度必须优化，以确保高纯度（宿主细胞蛋白质的低结合）和高产率（组氨酸标记的目标蛋白质的强结合）之间的最佳平衡。
  分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度; 在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑;咪唑的梯度不大（20 个或更多的柱床体积），可能分离出有相似结合强度的蛋白,
  若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白,需要考虑多步纯化的思路, 离子交换(HiTrap Q HP or HiTrap SPHP) 和凝胶过滤 (Superdex? Peptide, Superdex 75 or Superdex200) 是必须的
  3,可能原因:杂质和标签蛋白结合在一起,
  策略:在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂;增加去垢剂的浓度,( 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20);或者在wash buffer中增加甘油的浓度(50%)减少非特异性的相互反应;考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。
  4,可能原因:洗涤不充分
  策略:增加洗涤的次数,使洗涤充分。

• ending (2013-11-26 16:34:34)

  
  你可以作一个梯度洗脱，调整咪唑的浓度试试，另外可以增长洗涤的时间

• qumm1985 (2013-11-26 16:34:54)

  我也在纯化组氨酸标签的蛋白，但用镍柱效果确实不好，我过了两次镍柱还是有相当的杂带，主要是比我的30kd的目的蛋白小的杂带，分子量比较接近，用凝胶过滤也不合适。我打算再过第三次镍柱，添加些去垢剂，如tween-20，添加甘油等

• remenb (2013-11-26 16:35:14)

  
  没摸好条件,最好看看相关的材料,用咪唑做阶段洗脱,或换NTA的试试

• xue258 (2013-11-26 16:37:40)

  
  亲和没想象的那么好，起个富集作用也不错的啊。
  
  建议尝试多部层析联用，诸如 IEC-AF-SEC

• 8s5g (2013-11-26 16:38:17)

  
  最近我也在做Ni-NTA纯化带六个组氨酸的蛋白，洗涤是用了40 、60、80、100mM的咪唑，最后用500mM洗脱下来的，换过其他的咪唑浓度和PH值，但总是会有一条杂条带，我的目的蛋白是25KD ，杂蛋白是45KD左右而且含量与目的蛋白差不多，不知道接下来该怎么办了