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【讨 论】B案例分析二-顽固性背景、杂带!
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目的蛋白分子量(kd)：150(膜蛋白）
1.制胶
分离胶：8% 浓缩胶：5%
2.蛋白样品制备
37度*30分
3.上样量： 50微克（总蛋白）
4.电泳（伯乐）
压缩胶电压：80v 时间：35分
分离胶电压：100v 时间：109分
5.转膜（湿转，20%甲醇）（伯乐）
恒压：120伏 时间：90分
6.封闭
1*TBST/5%奶粉 RT*2小时（温度约20度）
7.洗： 1* 5 分
8.一抗孵育（SANTA CRUZ 多克隆抗体）
稀释液：封闭液 稀释比:1比一千、2千、4千 4度过夜
8.洗
1X TBST 5* 5分
9.二抗孵育（中杉金桥）
稀释液：封闭液 稀释比：1比1万 RT*2小时
10.清洗
1X TBSＴ6*5分
11.显影，定影
结果见下（一抗说明书推荐浓度1比1000，二抗说明书推荐浓度1比5，000-100，000）
12.14一抗1比1000
12.19一抗1比1000、2000
12.24一抗1比4000
其他条件见上
下方为目的蛋白所在区，上方可能为杂带，总是无法消除，泳道也总有背景
不知道到底主要原因出在上样量过大？一抗浓度过高？二抗浓度过高？还是怎么回事，特请高人指点！!!
感激！！！！！
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最新回复
lxh031 (2013-11-28 22:05:30)
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lxh031 (2013-11-28 22:15:18)
12-19 一抗1比1000，2000
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lxh031 (2013-11-28 22:41:39)
12-24 一抗 1比4000
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njkph (2013-11-28 22:42:44)
feima+ (2013-11-28 22:43:03)
杂带是必须的，你所用的是多克隆抗体啥。就算是单克隆，很多抗体都可能出杂带。
至于背景，建议您在一抗孵育完后洗膜的时候可以适当延长洗膜时间，我都TBS 10min*2，+TBST 10min*3，一抗的结合力相对较强，不易被洗脱掉。这样背景就非常浅了。二抗则不能这么暴力的洗膜
bling (2013-11-28 22:43:27)
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是IP3么
leifengta (2013-11-28 22:43:51)
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不要用胰酶消化细胞下来再做，直接裂解，不然，膜蛋白都被你仍在胰酶液里了
leifengta (2013-11-28 23:06:50)
如果没有，我们就没必要来讨论你的这个问题了。
2、我个人认为，你这里全是待测样本。先这么认为，那么，我认为，你上面 的条带不是非特异的，而是特异条带。目的蛋白不一定就是一条带啊，不同的翻译后修饰会有不同的分子量啊。
3、中间的连接，也并非是背景，而是散在的目的蛋白。这个可以通过缩短曝光时间来消除。但背景干净的话，曝光多久都不会出来。
4、你这带型不是怎么好。和我曾经做过的几次结果很像。当然，我还是没有找出原因。不过，我认为的原因，你可以考虑下：a、蛋白上样量应相对减少，目的蛋白较多（不是主要问题），b、检查上样缓冲液中还原剂如巯基乙醇的量，c、低温处理样本，d、相对延长浓缩胶即上层胶长度
希望你能拿到好结果。
如果没有阴性和阳性对照，下面的实验，你就暂时别做了吧。
lxh031 (2013-11-28 23:07:11)
非常感谢楼上的指导！
打算降低上样量！
上样缓冲液是买的碧云天的，也不晓得还原剂的量如何！
低温处理样品不晓得是何原理，如何处理还望指示！
birdfish (2013-11-28 23:16:18)
2541 (2013-11-28 23:16:38)
我觉得你的封闭时间也可以相对减少一点点· · 时间长也会影响它的特异性结合的·· 会产生背景· 我以前封闭1个小时多，现在只是40到五十分钟。
再就是二抗的孵育时间，一个小时到2个小时应该还可以。我以前好几个小时背景特别深，现在一个小时多点。
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