维生素B6的测定——微生物法（二）

关键词: 农药标准物质
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4．菌种的制备与保存

①菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌(Saccharomyces Carlsbergernsis ATCC No．9080简称SC)纯菌种接人2个或多个琼脂培养基管中，在(30±O．5)℃恒温箱中保温18～20 h，取出于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存数星期以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天移种一次，连续2～3天，方可使用，否则生长不好。

②种子培养液的制备：加O．5 mL 50ng／mL的维生素B6标准应用液于尖头管中，加入5 mL基本培养基，塞好棉塞，于高压锅121℃下消毒10 min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。每次可制备2～4管。

5．操作步骤(整个步骤需要避光)

①样品制备：取样O．5～10 g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL锥形瓶中，加O．22mol·L -1H2S04 72 mL。放人高压锅121℃下水解5 h，取出，于水中冷却，用10mol·L -1NaOH和O．5mol·L -1H2S04调pH至4．5，用溴甲酚绿做指示剂(指示剂由黄色变成黄绿色)。将锥形瓶内的溶液转移到100 mL容量瓶中，用定容至100mL，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备测(保存期不超过36 h)，此为样液。

②接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两根管，在(30±O．5)℃的恒温箱中培养18～20 h。取出离心10 min(3000r／min)，倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加lO mL消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。

③标准曲线的测定：取吡哆醇标准中间液5 mL稀释至100 mL作为工作液，浓度为50 ng·mL-1，3组试管各加O．O、0．02、0．04、O．08、0．12、0．16 mL工作液，再加5 mL吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。

④试样的测定：在试管中分别加入0．05、0．10、0．20 mL样液，再加入5 mL吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，此为试样测定管。将制备好的标准曲线3组试管和试样测定管放人高压锅121℃高压10 min，冷至室温备用。

⑤接种和培养：在标准曲线3组试管和试样测定管中每管中加一滴接种液，于(30土O．5)℃恒温箱中培养18～22 h。

⑥测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白试管调零。550 nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含维生素战的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制维生素B6标准工作曲线，用试样测定管得到的吸光度值，在标准曲线上查到测定管内所含维生素B6的量。

6．计算

每个试样各测定管的吡哆醇含量为ρ1、ρ2、ρ3；取液量分别为V1、V2、V3，各样管的吡哆醇含量ρ为：

   ρ（ng·mL-1）=(ρ1/ V1+ρ2/ V2+ρ3/ V3)/3

样品重m(g)，取液量V(mL)，定容至100 mL，则样品的吡哆醇含量。为：

   ω(mg·(100 g) -1)=
ρ×V×102／(m×106)=
ρ×V/(m×104)

7．说明

①所有步骤需要避光处理。

②试管应先用洗衣粉清洗后，用水冲净，再放人酸缸中浸泡1天左右，捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净，晾干，方可再用。