【求助】western蛋白浓度测定

最新回复

• remenb (2013-11-29 18:04:06)

  按照BCA法进行蛋白浓度测定 是不可以,只有用非干扰型蛋白浓度测定试剂盒 (SK3071)
  
  直接上样跑电泳不可以，必须补加DTT，在震荡煮沸

• mercedes (2013-11-30 09:10:26)

  谢谢您的回答，但是我刚咨询了一个师姐，她说组织裂解后直接按BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度就可以不必做别的处理，想保存的样品再加入上样缓冲液震荡煮沸后放冰箱保存就可以了。不知道您说不可以的理由是什么？

• remenb (2013-11-30 09:11:26)

  
  加2*Protein SDS Loading Buffer 煮后,是不能够直接用BCA定量的

• mercedes (2013-11-30 09:17:55)

  
  那我想用BCA法测定的话样品应该如何处理？剩余的样品该如何处理并保存呢？求教了！谢谢

• mercedes (2013-11-30 09:18:15)

  
  补充一下：我现在得到的一种说法是样品加入裂解液后制成匀浆，然后4度离心取上清，即可测定蛋白的浓度。剩余样品加入 2*loading buffer后煮沸放入-20度冰箱即可，但是要在两周内进行western，您看可以吗？

• any333 (2013-11-30 09:22:29)

  
  可以的，加热变性前先用BCA法把蛋白浓度测了，其他的假如loading buffer（1：5）煮诽变星后负80度保存备用。

• remenb (2013-11-30 09:23:16)

  
  蛋白定量是煮之前好呢，还是煮之后好呢阿

• remenb (2013-11-30 09:23:32)

  
  我现在是煮沸后再蛋白定量，怎么只加裂解液的空白对照孔OD值也很高呢？

• mercedes (2013-11-30 09:24:11)

  
  蛋白定量是不能煮沸的，煮沸之后蛋白就会变性没法测了。

• mercedes (2013-11-30 09:33:38)

  
  我也得请教个问题 ：
  
  我的大鼠海马一侧约重50毫克，按照我买的RIPA裂解液要求每20毫克组织用200微升，我得用500微升裂解液对其进行裂解制成匀浆，然后加入PMSF使其终浓度为1毫摩尔。然后4度离心取上清液测定蛋白浓度。我买的碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒，您说我这样品里还需要加入2*SDS蛋白上样缓冲液再进行浓度测定吗？加的话量得用多少啊？还是直接裂解完了就测定？其余的剩余样品是不是直接加入2*SDS蛋白上样缓冲液煮沸5分钟然后-80度保存就可以用于以后的western上样呢？2*SDS蛋白上样缓冲液要加多少？我下周一测，但是今天又听到不同的版本了，还得请大家帮我确认一下！

• mercedes (2013-11-30 09:34:00)

  
  我有个老师告诉我样品处理时要加入G250考马斯亮蓝溶液用于蛋白浓度测定，不能加上样缓冲液，然后用分光光度计测定吸光度。可是我是用酶标仪在96孔板上进行加样需要加G250考马斯亮蓝溶液吗？

• jkobn (2013-11-30 09:35:05)

  
  现在测蛋白浓度用得比较多的主要是Bradford和BCA，
  
  Bradford 会受到去污剂比如 TristonX-100的影响；
  
  BCA 则会受到还原剂的干扰，两者某种程度上可以互补。
  
  你老师说用G250指的应该是Bradford的方法，可以查一下相应的说明书，
  
  测A595.按照说明书操作就好了。
  
  用酶标仪会更简便些。

• mercedes (2013-11-30 09:35:46)

  
  重点是我现在不用Bradford,因为我已经买了BCA蛋白浓度测定试剂盒，那我的样品处理还用加考马斯亮蓝溶液吗？用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定的话样品到底该怎么处理呢？急求帮助！