【求助】120KD蛋白的转膜条件及相关影响因素

最新回复

• redbutterfly (2013-11-30 10:27:02)

  我用bio-rad的230MA，2小时120KD都挺好，beta-actin是看家基因表达量较高，才有清晰条带，其它基因不一定会，但最后也能做出来的。你可往下做看看。

• 969 (2013-11-30 10:27:23)

  
  谢谢，我做过很多次，用化学曝光发，都没条带，上样量是梯度：100，130，150，180，200，230微克。因为抗体是新买的，美国ABR公司的，所以一直怀疑是转膜步出差错了，因为二抗，为公用，内参有结果，二抗没问题

• redbutterfly (2013-11-30 10:28:01)

  这样子啊，做个dot blotting看看。或是提高一抗浓度。

• 969 (2013-11-30 10:28:27)

  
  现在关键是转膜后，立春红染色没有条带。而国产机子最大的电流是200毫安，只能延长转膜时间了

• 969 (2013-11-30 10:29:12)

  
  有点杂交的操作步骤吗？在膜上加提的原始蛋白呢？（指没加Loading buffer)还是加后的上样蛋白？具体说一下好吗？我听说过做点杂交，但具体没做过，抗体是新的，美国ABR公司的，谢谢

• bring (2013-11-30 10:29:32)

  
  是不是转膜条件不行，转膜过头了！

• 969 (2013-11-30 10:30:35)

  
  是不是转膜条件不行，转膜过头了！

• 969 (2013-11-30 11:14:33)

  
  我40V过夜转膜后，染胶还有弱条带。

• redbutterfly (2013-11-30 11:14:59)

  把NC膜（亲水性好）剪成小张，放12孔板里，蛋白（指没加Loading buffe的)用tip吸了慢慢点上去，一定看着它被膜吸收了。自然干燥一下，室温封闭30min，然后一抗室温1.5h，洗膜tbst 10min 3次，二抗室温45min，洗膜tbst 10min 3次，DAB显色或ECL都可以。一抗可做个梯度。

• 969 (2013-11-30 11:15:24)

  
  本人最近做WB,目的蛋白NCX-1---120KD,胶用考马斯亮蓝染色,120KD处有条带(虽然不一定是我的目的蛋白)而转膜后一直没条带(指转膜后立春红染色),各种转膜条件试了不少,如200MA,3-4小时,30-40V过夜(国产机子),但都没 条带.NC膜(0.44微米),而我的内参:beta-actin 200MA,2小时,效果很好
  转膜缓冲液配方:转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g
  Tris（MW121.14） 5.8g
  SDS 0.37g
  甲醇 200ml
  蒸馏水至 1000ml
  大家,给点建议?调节SDS与甲醇的比例?，请大家指点迷津，谢谢！
  
  希望大家给于帮助，谢谢！

• wmp1234 (2013-11-30 11:15:56)

  
  200mA 3-4小时，转膜后丽春红染不出，可能是转膜过了。
  我今天就在做120kDa的蛋白，200mA转膜60min条带稍微淡一点点，90min和120min几乎没差别。

• INK (2013-11-30 11:16:23)

  我做过110KD的，用350MA，70分钟，效果可以，丽春红可以看出条带。不过我上样是50ug.

• eric930 (2013-11-30 11:16:45)

  
  干嘛用sds呢。。。拿掉

• shenkunjie (2013-11-30 11:18:15)

  是不是转过了啊，200mA，2.5h试试。