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【求助】我的p-Akt怎么有这么多杂带呢？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2013-12-01 11:57    作者: Ao7    来源: 分析测试百科网

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【求助】我的p-Akt怎么有这么多杂带呢？
最近做了几次p-Akt的WB，前几次出的结果比较好。可是近来经常出现很多非特异性杂带，而有的时候没有任何条带。是blocking buffer 的原因？我用的是skimmilk。可是前几次处的挺好的。唯一的区别我想可能是我的2抗用的是不同的分装瓶的。难道是2抗的原因？请大家帮忙分析一下。多谢！
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最新回复

  • Ao7 (2013-12-01 11:59:12)

    还有一张，是另一次的结果，相同的曝光时间，几乎没有任何条带。比较奇怪。


    29272168.jpg

  • guagua (2013-12-01 11:59:30)

    我之前也出现这样的问题，最后换了另一种二抗就好了，你要不换别人的试试？

  • veiwu (2013-12-01 12:00:13)


    应该是二抗的问题，因为显示的是蛋白所在位置的条带，而无蛋白的膜部分基本上没有背景，因此可以理解封闭还是合格的。如果问题在封闭之后那就是一抗，二抗和洗膜了。调整一下抗体浓度，适当多洗一些时间，我想会好的。但是第二张片子就不太好解释了。我做了AKT的两个磷酸化位点，很多时候结果不是很好，但是改进一些方法之后感觉还可以。能不能交流一下你的转膜条件？还有是AKT的哪一个位点。谢谢！

  • Ao7 (2013-12-01 12:00:31)


    我用的是湿转，200mA，1小时。磷酸化在AKt的Ser473。我正在准备新的样品，备好了新的2抗，有结果后告诉大家。

  • Ao7 (2013-12-01 12:00:48)


    报告结果：使用新的2抗后，终于得到了理想的figure。这样就可以解释上面的2张图片了。第1张杂带多是因为2抗特异性差，第2张是2抗灵敏度差。我想是这个原因。哎，耽误了有1个多月的时间，原来就是这个2抗的原因。教训很深刻啊！


    15331732.jpg

  • 大脑门儿儿 (2013-12-01 12:01:24)

    恭喜你，我也在做p-AKT。想请教下你蛋白上样量是多少ug？收的是什么细胞？还有你用的一抗是CST吧，稀释度是1:1000吗？
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