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【求助】western blot 背景
最近学做western blot， 实在不顺利。主要是背景太暗，怎么办呢？【求助】western blot 背景
我们是买的蛋白为抗原，一抗是人血清，二抗是羊抗人的。蛋白跑电泳然后转膜，丽春红染色，晾干，切条，然后每条用不同的血清来孵育。做了两三次了，还是背景很深，一片黑。
封闭液：5%的脱脂奶粉，封闭一小时 一抗：1:200，孵育一小时 二抗：1：4000 孵育一小时
请各位专家指点。
哎，再做不好，我就真是不想 live 了
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最新回复
子衿青青 (2013-12-01 12:03:27)
会不会上样量少了，每孔300纳克左右的protein 跑胶。
希望有人能回答一下，版主帮帮忙
jujuba (2013-12-01 12:03:50)
你的转移缓冲液，需要过滤，最好用millipore水配制。
转膜时，所用的器皿，用去污剂充分刷洗后，蒸馏水冲洗干净。
封闭和洗脱的TBS/PBS，用0.45的滤膜过滤一下
不要用镊子去夹膜
lorri (2013-12-01 12:04:37)
请问电泳液和电转液过滤的时候用普通滤纸过滤可以吗？转膜用的滤纸需不需要处理，比如每次用完后用双蒸水彻底冲洗干净？谢谢
jujuba (2013-12-01 12:05:08)
可以用蒸馏水，然后普通滤纸过滤，最好细一点的。
转膜的滤纸，如果是PVDF膜，在甲醇里面沉浸15sec，在过滤后的的水里沉浸2min，然后在转移缓冲液里沉浸5min以上。
洗涤滤纸的容器，最好用塑料的。避免用金属镊子接触。
子衿青青 (2013-12-01 12:05:27)
今天封闭液改成了3%，好像好些了。
yapuyapu (2013-12-01 12:05:50)
mickeylin (2013-12-01 12:06:11)
不用金属镊子碰触的话用什么呢，用带PE手套的手可以吗
vcve (2013-12-01 12:06:39)
为什么要用塑料的，能解释一下吗?
我是把海绵，滤纸，硝酸纤维膜，胶，都用transfer buffer泡到一起了，哎，用的是一个玻璃缸。
NBA (2013-12-01 12:09:32)
QUOTE:
我的也是个人经验，仅供参考。一抗浓度也是个关键点。有些蛋白，例如actin，我的一抗稀释度是1:20000，而有的抗体我的稀释度则是1:50。根据情况自行调整。
塑料容器比较好洗涤，玻璃缸也可以的，但是每次用完之后，用去污剂洗涤，反复冲洗干净沥干备用。
不用镊子，可以用tip头啊。手，包括手套都不要碰到膜。
bling (2013-12-01 12:09:50)
tip头是？
子衿青青 (2013-12-01 12:10:08)
让我试试
刚学做western，每次转移胶的时候，总担心烂胶。呵呵，感觉它就跟凉皮似地
NBA (2013-12-01 12:10:29)
tip头，就是那个黄色的200ul枪头啊。
tip头是用来固定膜的，就是用tip头固定膜的一个角，然后倒掉需要更换的溶液。
胶可以用bio-rad那个塑料铲子转移。
子衿青青 (2013-12-01 12:10:47)
我的蛋白是28kd的，transfer buffer里加不加sds（紧急求助）
我今天做了一下，用的是以前的含sds 的transfer buffer，立春红染色效果不好
而且好像条带发虚，不是很实实在在的一条红带，好像有泡，但我在转膜时特小心的看了，那是可没有夹杂气泡
子衿青青 (2013-12-01 13:30:33)
真郁闷，人家染色都是一条实在红线，就我的不知怎么搞的。又不想活了。
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