【求助】考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白浓度

最新回复

• remonte (2013-12-01 22:45:47)

  水中是不是有杂质蛋白污染？

• glass (2013-12-01 22:46:05)

  
  我也遇到过你这种情况，但好象对结果影响不大吧，我测的标准曲线R值都超过0.99

• biabiade (2013-12-01 22:46:25)

  
  对，对结果影响不大，照样可以染胶，丝毫不会影响敏感性

• tangxin_80 (2013-12-01 22:46:42)

  
  我想问一个弱智的 问题，用G－250如何测蛋白的浓度 啊。

• lorri (2013-12-01 22:47:08)

  转：
  考马斯亮兰法（Bradford法）
  
  （一）实验原理
  
  1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
  
  Bradford法的突出优点是：
  
  （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
  
  （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
  
  （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
  
  此法的缺点是：
  
  （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
  
  （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
  
  （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

• kewanqi2011 (2013-12-01 22:47:37)

  我不是染胶，
  是测定蛋白浓度......
  
  ==================
  
  对，对结果影响不大，照样可以染胶，丝毫不会影响敏感性

• yychen (2013-12-01 22:47:57)

  
  这是操作流程
  
  1. 完全溶解蛋白标准品，取10ml稀释至100ml ，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
  但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
  
  2. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20微升(一般每个梯度做五个)。
  
  3. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20微升。
  
  4. 各孔加入200微升G250染色液，室温放置3-5分钟。
  
  5. 用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。
  
  6. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

• newway (2013-12-01 22:48:38)

  
  楼主 我也遇到了这种问题 觉得测的蛋白含量就不准了 楼主最后是怎么解决的啊